眼部不同方式注射川芎嗪抑制小鼠视网膜新生血管形成的比较研究

易细香，徐 敏，傅 培

（北京大学深圳医院眼科，广东 深圳518036）

视网膜新生血管形成，是糖尿病视网膜病变、眼底血管栓塞、缺血性眼病等最终导致视力丧失的重要原因，迄今尚无有效的治疗方法。川芎嗪在改善血液流变学异常、改善微循环方面有一定优势。穴位注射是传统的针灸疗法与现代的注射、封闭方法相结合的有效而无副作用的治疗方法。本文从形态学、分子生物学方面探讨川芎嗪对视网膜新生血管形成的干预作用，并探讨安全有效、无创的局部给药途径，为治疗血管源性眼病开辟新的给药途径。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 出生后第7天的健康C57BL／6J幼鼠90只，雌雄不限，未断奶与哺乳母鼠共同饲养，广州动物实验室提供，动物合格证号：0097634。

1.1.2 仪器 电脑氧气浓度控制仪(产地青岛，型号MBKY-2F)、光学显微镜（德国Leica DM4000B）。

1.1.3 试药 盐酸川芎嗪注射液(20 mg／mL)，常州制药厂生产，批号：001002。

1.2 方法

1.2.1 造模与分组 参考Smith等[1]和张正培等[2]的方法建立氧诱导的血管增生性视网膜病变幼鼠模型，取健康幼鼠C57BL/6J 90只，随机分为正常对照组，模型对照组（A组）、太阳穴穴位注射组（B组）、睛明穴穴位注射组（C组）、玻璃体腔注射组（D组）、鼠尾静脉注射组（E组），每组15只，与哺乳母鼠一起置于干燥密闭玻璃容器内，提供足够的食物及水。除正常组外，其他组予以持续高氧混合气体(75%氧气和25%氮气)，在此高氧环境中饲养5 d后将幼鼠取出，回到正常空气环境下饲养养，建立氧诱导视网膜新生血管病变幼鼠模型。

1.2.2 给药方法 根据中国针灸学会实验针灸研究会制定的实验动物针灸图谱取穴，B组、C组分别取小鼠太阳穴、睛明穴，针1～3 mm，推药前捻转刺激后用装有川芎嗪注射液的微量注射器，推药0.02 mL，(含川芎嗪0.4 mg)，每日1次，连续7 d；D组玻璃体腔注射川芎嗪注射液0.01 mL(含川芎嗪0.2 mg)，E组鼠尾静脉注射川芎嗪0.02 mL(含川芎嗪0.4 mg)，每日1次，连续给药7 d；正常组与模型对照组每天鼠尾静脉注射等容积生理盐水0.02 mL，每日1次，连续给药7 d。

1.2.3 视网膜新生血管细胞核计数 治疗结束5 d后所有小鼠颈椎脱臼处死，取出右眼，4%多聚甲醛溶液固定24 h，脱水、透明、浸蜡、切片。采用厚度为6μm的连续切片，切片方向平行于角膜至视盘的矢状位平面。常规苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察结果。每只眼球间断取10个病理不含视乳头切片，相邻两个切片间隔60μm(10个切片)，计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数目，统计平均每只眼球每张切片突破内界膜的血管内皮细胞核数。

1.2.4 动物血清血管内皮生长因子（VEGF）含量测定 小鼠处死后眼球采血。采用双抗体夹心法测定血清血管内皮细胞生长因子含量，操作方法按说明书进行。

1.3 统计学分析

2 结果

1.1 视网膜新生血管内皮细胞核数

正常对照组15眼有5眼见极少数突破内界膜的视网膜血管芽，其细胞核数为1～10个，其余10眼均未见视网膜新生血管芽；其余组均可见视网膜新生血管芽，发生率为100%。A组（130.83±41.63）个与正常对照组（6.56±3.41）比较（P＜0.01），差异有统计学意义，说明造模成功。B、C、D、E组均低于A组，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；B组分别与D组、E组比较，D组与E组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；C组分别与B组、D组、E组比较，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。见表1。

表1 各组小鼠视网膜新生血管芽细胞核数 （±s，n=15）

表1 各组小鼠视网膜新生血管芽细胞核数 （±s，n=15）

注：与模型对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01；与睛明穴注射组比较*P＜0.05，**P＜0.01。

组 别 给药剂量(mg/只)血管内皮细胞核数目（个）血清VEGF含量(mg/L正常对照组 — 6.56±3.41# 9.28±1.26#A组 — 130.83±41.63** 18.31±4.33**B组 0.40 68.39±32.07*# 13.35±2.41*##C组 0.04 75.23±27.12# 15.25±3.37##D组 0.02 58.56±36.21*# 12.32±2.53*#E组 0.04 59.39±21.78*# 12.37±3.11*##)

2.2 各组血清VEGF含量

B、C、D、E组均低于A组，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05），说明川芎嗪能有效抑制氧诱导小鼠VEGF形成；B组分别与D组、E组比较，D组与E组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；C组分别与B组、D组、E组比较，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表1。

3 讨论

大量研究表明，缺氧是导致视网膜新生血管形成的主要刺激因素，将生后1周内C57BL／6J幼鼠置于75%浓度的氧环境中连续生活5 d，回到正常空气环境下饲养，即可见大量的视网膜新生血管形成[1]，先是高氧阶段的血管闭塞和消失，正常发育中的视网膜血管停止生长，然后是进入空气相对低氧的环境下，导致了在缺氧状态下的视网膜血管异常增殖。缺氧可促进VEGF的合成[3]，受缺氧调节的特性使其成为最重要的促新生血管形成因子，参与缺氧诱导有关的眼内新生血管形成[4]。本文通过视网膜新生血管芽细胞核计数来判断视网膜新生血管的增殖程度，新生血管芽细胞核数越多表明视网膜新生血管增殖越严重。本实验结果显示造模成功。

中药川芎含有川芎嗪、阿魏酸钠、川芎内酯等化学成分，川芎嗪是其主要有效活性成分。川芎嗪有较强的扩张微血管、改善微循环、降低血黏度、改善血液流变、降低毛细血管通透性、调节血小板功能和抗凝作用。川芎嗪对糖基化终产物(AGEs)诱导的人视网膜色素上皮细胞产生VEGF具有抑制作用[5]；可通过抑制DNA合成来抑制成纤维细胞的增殖[6]；倪峰[7]研究说明经络穴位对药物有快速吸收和放大的效应。穴位注射药效具有高效性与速效性；具有穴效药效“迭加效应”，能减少用药量，提高疗效，是一种简易而又有效的眼局部治疗方法。睛明穴与太阳穴位于眼周，为眼部穴位注射常用穴位。玻璃体腔注药抗VEGF治疗近年临床应用较多，但玻璃体腔注药为有创操作，术后并发症较多。蔡东梅通过双侧针刺糖尿病视网膜病变大鼠睛明、太阳等穴，电镜观察大鼠微血管病变得到显著改善[8]。

本实验结果表明，应用川芎嗪后，各注射组与静脉注药组小鼠血清VEGF含量明显低于模型组（P＜0.05，P＜0.01），而且治疗组视网膜新生血管细胞核数目较模型组明显减少，组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），这一结果表明川芎嗪能有效抑制视网膜新生血管细胞形成、具有抗血清VEGF作用，说明川芎嗪对视网膜新生血管增殖具有抑制作用；川芎嗪太阳穴注射组与玻璃体腔注射组、静脉给药组间比较，小鼠血清VEGF含量、小鼠视网膜新生血管芽数目差异无统计学意义，说明川芎嗪太阳穴穴位注射与玻璃体腔注射、静脉给药疗效相当；睛明穴穴位注射组与玻璃体腔注射组、静脉给药组间比较，小鼠血清VEGF含量、小鼠视网膜新生血管芽数目差异有统计学意义（P＜0.05），说明川芎嗪睛明穴穴位注射疗效不如玻璃体腔注射、静脉给药途径；川芎嗪太阳穴注射组与睛明穴穴位注射组疗效比较，睛明穴穴位注射组小鼠视网膜新生血管细胞形成数目与血清VEGF均高于太阳穴注射组（P＜0.05），说明睛明穴穴位注射组疗效不如太阳穴注射，太阳穴注射疗效更佳。

太阳穴位于颞浅动脉旁，颞浅动脉旁注射复方樟柳碱治疗缺血性眼底病在临床广泛应用[9-10]，其机制是通过颞浅动脉旁的自主神经末梢使脉络膜血管活性物质维持正常水平，增加眼血流量，有助于解除脉络膜血管痉挛，恢复脉络膜血管正常舒缩功能促进侧支循环的建立，减轻脉络膜缺血所导致的视神经、视网膜缺血的病理改变，由于其简单易行而被广泛采用。

视网膜新生血管增殖的中药治疗目前尚处于初期研究阶段，川芎嗪给药新方式如球周穴位注射、玻璃体腔注射，新剂型的开发如膏药穴位敷贴等，均具有很好的研究和应用前景。本实验玻璃体腔注射微量川芎嗪，无一例发生眼内炎，但璃体腔注射为有创操作，其安全性需进一步研究，川芎嗪太阳穴穴位注射疗效同玻璃体腔注射，安全，疗效确切，为局部无创治疗的最佳选择，本实验为治疗血管源性眼病开辟新的安全有效、简便实用给药途径提供实验依据。

[1]Smith Lois EH，W esolowski E，Mciellan A，et a1.Oxygeninduced retinopathy in the mouse[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，1994，35(1)：101-111.

[2]张正培，陈钦元，管孝群，等.重组血管生成抑制因子k4k5抑制视网膜新生血管形成的实验研究[J].中华眼底病杂志，2003，19(2)：121-124.

[3]Nomura M，Yamagishi S，Harada S，et al.Possible Participationof autocrine and paracrine vascular en dothelial growthfactors in hypoxia-induced proliferation of endothelial cellsand pericytes[J].J Biol Chem，1995，270(47)：28 316-28 324.

[4]周洪伟，关 强.血管内皮生长因子及其受体与眼底新生血管[J].国际眼科杂志，2007，7(3)：791-795.

[5]陈忠平，姜德咏.川芎嗪对糖基化终产物诱导人视网膜色素上皮细胞表达血管内皮生长因子的影响[J].中国现代医学杂志，2007，17(16)：1 945-1 949.

[6]陈学忠.川芎嗪、丹参对体外培养成纤维细胞的作用[J].中西医结合杂志，1987，7(9)：541-543.

[7]倪 峰，林静瑜，周春权，等.穴位注射疗法作用机制探讨[J].中国针灸，2003，23(10)：609-611.

[8]蔡东梅，张秀萍，郝琳娜，等.针刺对糖尿病视网膜病变影响的实验研究[J].中国针灸，2002，22(3)：186-188.

[9]宋 琛.缺血性眼病治疗新概念[M].北京：人民军医出版社，2005：84，90，97.

[10]张金生.复方樟柳碱治疗糖尿病视网膜血管病的临床观察[J].中西医结合心脑血管病杂志，2008，6(4)：502-503.