TNF-α和IL-1β对人脐静脉内皮细胞蛋白C受体mRNA表达的影响

郭小芳 刘海波 任惠龙 龚维坤

浙江省宁波市鄞州人民医院 宁波 315040

成兴波 苏州大学医学院附属第一医院

TNF-α和IL-1β对人脐静脉内皮细胞蛋白C受体mRNA表达的影响

郭小芳 刘海波 任惠龙 龚维坤

浙江省宁波市鄞州人民医院 宁波 315040

成兴波 苏州大学医学院附属第一医院

目的：观察肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）对人脐静脉内皮细胞（ECV304）蛋白C受体（EPCR）mRNA表达的影响。方法：通过体外培养ECV304细胞，分别以含TNF-α和IL-1β的培养基孵育ECV304细胞，行剂量和时间依赖性实验。采用实时定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR）技术测定ECV304细胞EPCR mRNA的表达。结果：TNF-α和IL-1β均能显著下调ECV304 EPCR mRNA的表达，并呈剂量和时间依赖性（P＜0.05）。结论：TNF-α和IL-1β可能通过显著下调ECV304上EPCR mRNA的表达而成为损伤内皮细胞功能的一个新作用机制。

内皮细胞 肿瘤坏死因子 白细胞介素-1 内皮细胞蛋白C受体

内皮细胞功能受损是动脉粥样硬化的始动因素，也是心脑血管疾病发生的重要原因[1]。既往研究[2]显示，肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）作为炎症细胞因子，在内皮细胞功能受损及动脉粥样硬化中发挥重要的作用，但其作用机制尚不十分清楚。内皮细胞蛋白C受体（endothelial protein C receptor，EPCR）是近年发现的蛋白C（protein C，PC）系统的一个新成员，主要表达于内皮细胞，它能与PC特异性结合，使PC活化效率提高5倍，而发挥抗凝作用，近年的研究表明EPCR也有重要的抗炎作用[3-5]。而炎症因子是否通过影响EPCR而损伤内皮细胞功能，目前还不十分明确。本研究观察炎症因子TNF-α、IL-1β对EPCRmRNA表达的影响，探讨炎症因子损伤内皮细胞功能的新机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 RPMI-1640培养基购自美国Gibco公司；小牛血清、胎牛血清购自杭州四季青公司；琼脂糖购自美国Amresco公司；胰酶购自Difcd公司；FITC-羊抗鼠二抗购自Immunotech公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；DEPC购自BBI公司；M-MLV、随机引物和dNTP购自美国Promega公司；RNA酶抑制剂（Rnasin）购自上海华美生物技术公司；Taq酶、人重组肿瘤坏死因子（TNF-α）、人重组白介素-1β（IL-1β）购自上海晶美生物工程有限公司；ECV304为苏州大学附属第一医院血栓与止血研究室冻存细胞株；鼠抗人EPCR多克隆抗体由王迎春教授惠赠；鼠抗人单克隆β-actin购自Sigma公司。

1.2 主要仪器 Ex TaqTM R-PCR Version 2.1购自大连宝生物公司；Eva Green购自美国Biotium公司；实时定量（real-time）PCR仪MJ Research Option2TM购自MJ公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

1.3 方 法

1.3.1 人脐静脉内皮细胞培养 人脐静脉内皮细胞株ECV304细胞用含15%小牛血清的RPMI-1640培养基按常规实验方法培养。实验用为其3～5代。

1.3.2 实验方法 实验一：ECV304细胞用含TNF-α的低血清（含3%小牛血清）RPMI-1640培养基培养12h，观察不同浓度TNF-α（2、10、25ng∕mL）时EPCR mRNA的表达；同时以含TNF-α10ng∕mL的低血清（含3%小牛血清）RPMI-1640培养基培养ECV304细胞，行时间依赖（1、3、6、12h）实验。以相同时间的不加刺激剂组为对照。实验二：ECV304细胞用含IL-1β的低血清（含3%小牛血清）RPMI-1640培养基培养12h，观察不同浓度IL-1β（5、10、20ng∕mL）时EPCRmRNA的表达；同时以含IL-1β10ng∕mL的低血清（含3%小牛血清）RPMI-1640培养基培养ECV304细胞，行时间依赖（0.5、3、6、12h）实验。每个实验组设5个复孔，每次实验重复3次。采用逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）技术检测EPCRmRNA的表达。

1.3.3 总RNA抽提及逆转录 利用Trizol试剂从各组ECV304细胞中提取总RNA，并将mRNA浓度调整至0.5g∕L。常规方法逆转录。

1.3.4 聚合酶链反应（polymerase chain reaction， PCR） β-actin引物序列：上游 5′-CTCGCGC⁃TACTCTCTCTTTC-3′，下游5′-CAGTCTCGATCCCACTTAA-3′，扩增片段330bp。EPCR引物序列：上游：5′-ATTGCTGCCGATACTGCT-3′，下游：5′-AGAGGAAAGGCCAAGGTC-3′，扩增片段318bp。以上序列由上海生物工程有限公司合成。以β-actin（330bp）作内参照。反应条件：EPCR为94℃4min后开始循环，94℃40s→58℃40s→72℃40s，共30个循环，最后72℃10min充分延伸；β-actin为94℃4min后开始循环，94℃40s→58℃40s→72℃40s，共28个循环，最后72℃10min充分延伸。反应后1.5%琼脂糖凝胶上样，电泳鉴定结果。

1.3.5 实时定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，real-time PCR） 反应体系：5× buffer5μL，Mg2+（250Mm）0.25UL，dNTP（10Mm）0.75μL，Taq酶（250U∕50ul）0.25μL，上游引物（10Mm）0.5μL，下游引物（10mM）0.5μL，Evagreen（10mM）0.5μL，双蒸水15.45μL，cDNA 2μL，共25μL体系；反应条件：95℃5min预变性，95℃15s→58℃25s→72℃25s→78℃0.1s；读板；50个循环；60℃～96℃0.3s融解曲线；72℃5min；4℃，forever。结果计算公式：①相对量＝2－△C（T），△C（T）=目的基因C（T）－内参基因C（T）；②实验组∶对照组的相对量：2－△△C（T），△△C（T）＝实验组△C（T）－对照组△C（T）。

1.3.6 统计学方法 各次实验最终结果用均数±标准差（±s）作为统计资料。采用t检验或单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 RT-PCR结果 ECV304细胞膜上有较高的EPCRmRNA表达，见图1。

图1 ECV304细胞EPCR mRNA表达

2.2 TNF-α和IL-1β对ECV304细胞EPCR mRNA表达的影响

2.2.1 不同浓度TNF-α对人脐静脉内皮细胞（ECV304）EPCR mRNA的影响 ECV304细胞EP⁃CRmRNA水平采用real-time PCR测定。已80%融合的ECV304细胞中加入TNF-α使其浓度分别达2、10、25ng∕mL，以低血清（含3%小牛血清）RPMI-1640培养基培养ECV304细胞为空白对照。12h后EPCR mRNA分别是对照组（100%）的（48.28±0.95）%（P＜0.01）、（35.54±0.87）%（P＜0.01）、（25.42±0.50）%（P＜0.01），TNF-α2ng∕mL时即能明显下调ECV304细胞EPCRmRNA的表达，EPCRmRNA的表达呈剂量依赖性，见图2。

图2 不同浓度TNF-α对EPCR mRNA的影响

2.2.2 不同时间TNF-α对人脐静脉内皮细胞（ECV304）EPCR mRNA表达的影响 ECV304细胞EPCR mRNA水平采用real-time PCR测定。10ng∕mL TNF-α分别作用ECV304细胞1、3、6、12h。以低血清（含3%小牛血清）RPMI-1640培养基培养ECV304细胞为空白对照。与空白对照组（100%）相比，1、3、6、12h时EPCRmRNA水平分别是（56.42± 0.58）%（P＜0.01）、（46.38±0.49）%（P＜0.01）、（39.26± 0.61）%（P＜0.05）和（35.54±0.87）%（P＜0.01），TNF-α处理ECV304细胞1h时即能明显下调EPCRmRNA的表达，EPCRmRNA的表达呈时间依赖性，见图3。

图3 不同时间相同浓度TNF-α对EPCR mRNA表达的影响

2.2.3 不同浓度IL-1β对人脐静脉内皮细胞（ECV304）EPCR mRNA表达的影响 ECV304细胞EPCRmRNA水平采用real-time PCR测定。已80%融合的ECV304细胞中加入IL-1β使其浓度分别达5、10、20ng∕mL，以低血清（含 3%小牛血清）RP⁃MI-1640培养基培养ECV304细胞为空白对照。12h后EPCR mRNA分别是对照组（100%）的（40.70± 0.98）%（P＜0.01）、（34.44±0.56）%（P＜0.01）、（10.74± 0.36）%（P＜0.01），IL-1β5ng∕mL时即能明显下调ECV304细胞EPCRmRNA的表达，EPCRmRNA的表达呈剂量依赖性，见图4。

图4 不同浓度IL-1β对EPCR mRNA的影响

2.2.4 不同时间IL-1β对人脐静脉内皮细胞（ECV304）EPCR mRNA表达的影响 ECV304细胞EPCR mRNA水平采用real-time PCR测定。10ng∕mL IL-1β分别作用ECV304细胞0.5、3、6、12h。与空白对照组（100%）相比，0.5、3、6、12h时EPCRmRNA水平分别是（61.68±0.69）%（P＜0.01）、（61.05±0.59）%（P＜0.01）、（50.66±0.29）%（P＜0.05）和（32.94±0.93）%（P＜0.01），IL-1β处理ECV304细胞0.5h时即能明显下调EPCRmRNA的表达，EPCRmRNA的表达呈时间依赖性，见图5。

3 讨论

炎症因子是影响血管内皮细胞功能最重要的因素之一。现已证实TNF-α、IL-1为致内皮细胞损伤的重要炎症因子。它们可以启动炎症反应，从而导致血管内皮细胞损伤，是促使动脉粥样硬化发生发展的重要因素。

EPCR是近年发现的PC系统的一个新成员，是一个由221个氨基酸组成的Ⅰ型跨膜糖蛋白，主要表达于大血管内皮细胞，其通过凝血酶（thrombin）-凝血酶调节蛋白（thrombomodulin，TM）复合物增进PC活性，提高PC的活化率，从而发挥抗凝作用[6]。EPCR的抗炎作用是PC系统近年研究的重要进展[7]。在盲肠结扎穿孔致复合菌感染的脓毒症模型中，PC水平明显下降，同时EPCR表达代偿性增加[8]。

因此，TNF-α、IL-1β有可能是通过影响EPCR从而损伤内皮细胞的功能。目前国外的相关研究甚少，国内目前还未见相关报道。国外有研究发现TNF-α能显著下调EPCRmRNA表达[9-10]，并呈剂量依赖性。另外，Margarita等[11]发现IL-1β能促进内皮细胞释放可溶性内皮细胞蛋白C受体（sEPCR），并下调ECV304细胞表面EPCR的表达。上述研究虽分别表明TNF-α和IL-1β能通过下调EPCR的表达而损伤内皮细胞功能，但他们均是对单一炎症因子的研究，也未同时进行时间及剂量依赖性实验。而在本研究中同时纳入TNF-α和IL-1β这两种有代表意义的炎症因子，观察其对内皮细胞EPCR表达的影响，并同时进行了时间和剂量依赖试验，实验设计更合理，实验结果更具有说服力。本研究发现EPCR mRNA在ECV304细胞膜上表达，TNF-α在2ng∕mL时即能显著下调ECV304细胞EPCRmRNA的表达，并呈剂量依赖关系；TNF-α浓度为10ng∕mL时处理ECV304细胞，1h后即能观察到EPCRmRNA的表达较对照组显著下降，且呈时间依赖关系，同时也发现IL-1β具有类似的作用。本研究证明了TNF-α、IL-1β对EPCRmRNA表达的下调是其损害内皮细胞功能的新机制，这可能为动脉粥样硬化的防治提供了新的思路。

［1］De Caterina R.Endothelial dysfunctions：common denominators in vascular disease［J］.Curr Opin Lipidol，2000，11（1）: 9-23．

［2］于健宁，马纪林，陶筱娟.白鹤冲剂对TNF刺激的血管内皮细胞与嗜中性粒细胞黏附的影响［J］.浙江中西医结合杂志，2011，21（12）:840-843.

［3］Macias WL，Yan SB，Williams MD，et al.New insights into the protein C pathway:potential implications for the biological activities of drotrecogin alfa（activated）［J］.Crit Care，2005，9（4）:S38-S45.

［4］Esmon CT.Inflammation and the activated protein C anticoagulant pathway［J］.Semin Thremb Hemost，2006，32（1）: 49-60.

［5］O Brien LA，Gupta A，Grinnell BW.Activated protein C and sepsis［J］.Front Biosci，2006，1（1）:676-698.

［6］Van de Water NS，French JK，McDowell J，et al.The endothelial protein C receptor（EPCR）23bp insert in patients with myocardial infarction［J］.Thromb Haemost，2001，85（4）:749-751.

［7］Esmon CT.Crosstalk between inflammation and thrombosis［J］.Maturitas，2008，61（1-2）:122-131.

［8］Gupta A，Berg DT，Gerlitz B，et al.Role of protein C in renal dysfunction after polymierobial sepsis［J］.J An1 Soc Nephrel，2007，18（3）：860-867．

［9］Bicheng Nan，Peter Lin，Alan B，et al.Effects of TNF-α and curcumin on the expression of thrombomodulin and endothelial protein C receptor in human endothelial cells［J］.Thrombosis Research，2005，115（5）:417-426.

［10］Youqin Chen，Jun Peng，Xiaoheng Liu，et al.Activated Protein Cameliorates TNF-α induced Inflammatory Response of Endothelium Via the Endothelial Protein C Receptor［J］. Journal of Biomedical Engineering，2009，26（3）:625-630.

［11］Margarita Perez-Casal，Colin Downey，Kenji Fukudome，et al.Activated protein C induces the release of microparti-cle-associated endothelial protein C receptor［J］.Blood，2005，105（4）:1515-1521.

致作者

2013年1月1日起，请登录我刊官方网站http:∕zjzxy.alljournal.com.cn:8080投递稿件，或登录杭州市红十字会医院网站（www.hzhhyy.com）点击左上角《浙江中西医结合杂志》链接进入。本刊邮箱不再接受投稿，敬请谅解。

Effects of TNF-α and IL-1β on EPCR mRNA in endothelial cells

GUO Xiaofang,LIU Haibo,REN Huilong,et al.Yinzhou People’s Hospital,Ningbo(315040),China

Objective：To investigate the effect of tumor necrosis factor alpha(TNF-α)and interleukin-1 beta (IL-1β)on the expression of endothelial protein C receptor(EPCR)in human umbilical vein endothelial cells (ECV304).Methods:Cultured ECV304 were used as target cells.Different concentrations of TNF-αor IL-1β were added to the culture medium to establish the injury model of ECV304.EPCR mRNA were measured by quantitative real-time PCR.Results:The expression of EPCR in ECV304 was down-regulated by TNF-αand IL-1βin dose and time dependent manner.Conclusion:Both TNF-αand IL-1β may damage the function of endothelial cells by down-regulating the expression of EPCR mRNA.

endothelial cells tumor necrosis factor interleukin-1 endothelial protein C receptor

2012-09-24