枸杞多糖对新生鼠氯化甲基汞慢暴露染毒致成年期生育能力下降的干预作用

曹 池刘 香陈海斌罗 迈崔 静张 华王米佳王 丹田建英

（1宁夏医科大学基础学院，银川，750004；2宁夏自治区人民医院神经内科，银川，750004）

枸杞多糖对新生鼠氯化甲基汞慢暴露染毒致成年期生育能力下降的干预作用

曹 池1刘 香1陈海斌1罗 迈1崔 静1张 华2王米佳1王 丹1田建英1

（1宁夏医科大学基础学院，银川，750004；2宁夏自治区人民医院神经内科，银川，750004）

目的：探讨早期低剂量接触氯化甲基汞（Methyl Mercury Chloride，MMC）对大鼠生殖功能和生长发育的影响以及枸杞多糖（Lycium Barbarum Polysaccharides，LBP）的早期干预。方法：将60只健康7日龄大鼠随机分为对照组（CON）、MMC组、MMC +LBP组、LBP组，MMC组和MMC+LBP组均颈部皮下注射MMC，CON组颈部注射相同剂量的生理盐水，MMC+LBP组同时喂养LBP，雌雄合笼，自然观察各组体重发育以及生殖繁育能力以及子代仔鼠早期生长发育和存活状况。再将已孕母鼠哺乳期仔鼠染毒，观察母鼠产仔情况。结果：1）MMC组毛色萎缩，精神状态倦怠、动作不活泼、食欲不振。2）MMC组生长较缓慢且随染毒时间的延长而明显。3）MMC组染毒大鼠未产仔，MMC+LBP组有产仔，但产死率高、出生后存活率低于CON；LBP组产死率较CON低。4）MMC+LBP组有畸胎，且仔鼠出生体重与正常CON和LBP组仔鼠出生体重有统计学意义（P＜0.01）。5）染毒仔鼠影响其已孕母鼠再次生育。结论：MMC对大鼠有生殖发育毒性，LBP可抑制MMC引起的生殖毒性。

氯化甲基汞；枸杞多糖；生殖毒性

环境污染对生育力的影响引起越来越多的人关注。氯化甲基汞（MMC）是严重危害人类健康的蓄积性环境污染物，在食物链中有生物放大作用。存在于环境中的MMC对健康造成的影响主要表现为低剂量、长期暴露引起的非典型性、多系统的损伤。研究发现MMC对雄鼠的生殖能力可通过父系传播影响后代的生长发育和神经行为发育的变化［1］。枸杞多糖（LBP）是枸杞子的主要功能成分之一，具有多种药理作用和生物活性功能，其对生殖系统的保护作用亦有报道［2-4］，但是否能对MMC引起的生殖毒性有抑制作用尚未见报道。本实验通过LBP对新生鼠长期接触低剂量MMC导致其成年生殖毒性的干预作用观察，旨在为寻求抑制MMC的生殖毒性，减少对新生儿，青少年生长发育的危害新的早期干预途径。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂MMC（德国Merck公司）；LBP（上海康舟真菌多糖有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组 5～7 d健康二级清洁SD大鼠新生鼠60只（宁夏医科大学实验动物中心提供），体重9～12 g，动物房内清洁，噪音小于70 db，日光辅助照明，12 h／d，饲养温度为（22±2）℃。饲料为宁夏医科大学动物实验中心提供。适应性饲养3 d，随机分为4组，每组15只。MMC组（15只）：颈部皮下注射MMC造模；MMC+LBP组（15只），哺乳式喂养LBP（25 mg／mL），同时颈部皮下注射MMC；LBP组（15只）：只哺乳式喂养LBP；CON组（15只）：颈部皮下注射生理盐水。

1.2.2 体重增长量测定 各组体重增长量的计算方法为，给药10 d、20 d、30 d、40 d和50 d大鼠的体重增长，计算公式为：体重增长量＝（各时期体重-给药前体重）。

1.2.3 各组雌鼠分娩率和产仔情况的观察 观察交配雌鼠分娩和产仔情况，记录各组雌鼠的分娩率，产仔数、畸胎数、成活率等，如果该组雌鼠不产仔这些指标都按0计算。

1.2.4 仔鼠出生体重和早期生长发育观察 记录各组仔鼠出生体重，分别记录各组仔鼠出生后耳廓分离时间、毛发长出时间、开眼的时间和自主采食时间，并进行各组之间的比较。如果该组雌鼠未产仔，各项指标都按0计算。

1.2.5 仔鼠染毒对正常雌鼠产仔数的影响 选产仔的正常雌鼠若干只，其产仔后，再次受孕，哺乳期间，仔鼠与孕鼠不分笼，仔鼠随机分别标记，并给注射上述剂量的生理盐水、MMC、MMC+LBP，28 d，各组换垫料、给食、给水时间一致，观察记录受孕雌鼠二胎产仔情况。

2 结果

2.1 一般状况 与生理盐水CON相比，MMC组进食量较少、体重减轻，粪便较稀，垫料潮湿，毛色发黄，运动迟缓，精神萎靡、有个别个体显得较为暴躁；MMC+ LBP组体重、粪便、毛色、运动、精神等情况较MMC组减轻，较CON加重。

2.2 体重变化量 与CON相比MMC组和MMC+LBP组发育过程中体重增长缓慢，且随着时间的延长而明显，在给药20～40 d期间，生长速度减慢最明显，MMC+ LBP组大鼠随LBP给药时间延长体重增加，较MMC组差异有统计学意义（P＜0.05），由表1、表2可见。

2.3 MMC和LBP对大鼠生育能力的影响 MMC组分娩率零，MMC+LBP组雌鼠有分娩率，但产死率高，出现畸胎；CON组和LBP组雌鼠分娩率没有明显差别、存活率高且无畸胎，由表3可见。

表1 MMC和LBP对雄鼠体重增长的影响（n＝8，±s）

表1 MMC和LBP对雄鼠体重增长的影响（n＝8，±s）

注：与CON相比，**P＜0.01；与MMC组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别CON MMC MMC+LBP LBP 10 d 40.1±0.8 37.5±1.1**38.8±1.3 39.9±1.5 20 d 103.2±5.4 67.1±8.0**75.4±12.0**△102.1±3.9△△30 d 175.6±5.6 143.0±4.1**148.6±4.1**△179.1±3.6△△40 d 196.3±2.5 177.9±5.9**186.5±8.2**△199.4±7.7△△50 d 299.0±5.1 230.3±7.4**238.3±6.0**△297.1±7.0△△

表2 MMC和LBP对雌鼠体重增长的影响（n＝8，±s）

表2 MMC和LBP对雌鼠体重增长的影响（n＝8，±s）

注：与CON相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与MMC组相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别CON MMC MMC+LBP LBP 10 d 27.3±2.8 26.0±2.1 26.0±1.6 26.5±2.5 20 d 71.5±1.5 61.4±1.5**63.8±0.9**70.4±1.1△△30 d 101.9±9.7 72.0±5.1**75.5±7.1**97.5±12.9△△40 d 143.8±5.1 129.8±6.0**136.3±4.9*△147.1±7.1△△50 d 163.5±5.2 145.9±5.2**155.1±4.1*△166.9±3.7△△

表3 MMC和LBP对雌鼠分娩、产仔情况的影响

2.4 LBP对MMC染毒亲代产仔早期发育的影响 与CON比较，MMC+LBP组仔鼠出生体重与CON仔鼠出生体重都有统计学意义（P＜0.01）；耳廓分离时间没有统计学意义（P＞0.05），毛发长出时间、开眼时间和自主采食时间明显延长（P＜0.05）。LBP组仔鼠各项指标与CON没有统计学意义（P＞0.05），见表4。

表4 仔鼠早期发育情况（n＝8，±s）

表4 仔鼠早期发育情况（n＝8，±s）

注：与CON比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别CON MMC+LBP LBP 6.09±0.21耳廓分离时间（d） 4.9±0.8 5.2±0.8 5.1±0.6毛发长出时间（d） 5.3±0.5 5.9±0.7* 5.4±0.5开眼时间（d） 12.6±0.7 13.9±1.1* 13.3±1.0自主采食时间（d） 15.9±0.8 16.6±0.7*出生体重（g） 6.26±0.36 4.93±0.22**16.2±0.8

CON和LBP组仔鼠体长较长，体型较大，肤色红润有光泽，仔鼠肤色红润有光泽，MMC+LBP组仔鼠皮肤失去光泽，颜色呈暗紫色，并且有畸胎，其死胎呈黑色。

2.5 哺乳期仔鼠染毒对已孕母鼠生育能力的影响健康母鼠产仔后再次受孕，观察仔鼠染毒对母鼠的再次生育的影响，结果未染毒组母鼠产仔数均数为12只，MMC+LBP组产仔数为6只，MMC染毒组雌鼠未产仔。

图1 仔鼠染毒对已孕母鼠生育能力的影响

3 讨论

汞广泛存在于自然界中，在水和土壤中微生物甲基化作用下生成剧毒MMC，对环境及人体健康都具有极大的危害，被各国政府及UNEP、WHO等国际组织列为“优先控制的环境污染物”［5］。由于其环境中最稳定，具有生物体内高蓄积性［6］，脂溶性高，易于通过胎盘屏障和血脑屏障，极易造成对发育期的器官的损害，特别是对发育期的脑更敏感。MMC可影响神经细胞凋亡、引起生物膜和神经递质的改变。对儿童可有视觉、听觉，神经行为改变［7-8］。孕期汞暴露、可损害子鼠长期记忆，延迟神经系统发育相关基因的表达，引起结构功能变化［9-11］。

MMC是生活中常见的不易分解的蓄积性环境污染物，可通过食物链进入体内。其可以通过胎盘直接造成对胎儿的损伤，也可对卵细胞造成遗传损伤从而危害子代。吴美琴［12］等人研究发现汞可蓄积在人胎盘移出物中，具有明显的剂量-反应关系，这种蓄积作用可能会影响到胎盘的组织结构，甚至干扰胎盘的正常生物转化作用；也能透过血睾屏障，作用于雄性生殖系统，影响雄性动物的交配能力，作用于雄性生殖细胞dNA，造成遗传损伤从而影响子代生长发育［13］；Sitarek等研究发现，低剂量接触MMC对体重、耳廓分离、开眼时间等有显著影响［14］。

LBP是传统名贵中药枸杞子的重要有效成分，是从枸杞子中提取而得的一种水溶性多糖。已明确该多糖系蛋白多糖，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6种单糖成分组成，具有多种药理作用和生物活性功能，主要药理作用有：调节机体免疫功能、增强记忆力、抗氧化、耐缺氧、防辐射等［15-17］。现代科学研究表明，其具有免疫调节、抗氧化［18-19］，抑制Aβ诱导对原代神经元的毒性作用，尽管国内外尚少见关于LBP对抗环境污染，发挥保护作用的研究。有研究表明LBP能抑制微量MMC诱导的海马神经干细胞的损伤［20］，明显减轻温水浴导致的大鼠睾丸组织细胞的损伤程度。可显著改善大鼠交配能力，调节血清性激素水平的分泌。

本研究分别发现雌、雄鼠早期染毒，对其生长（体重增长量）、生育能力、和其仔鼠早期发育均有不良影响，结果显示MMC染毒鼠生长较CON缓慢、精神状态较差，长期染毒可致不孕不育，而MMC+LBP干预组雌鼠受孕分娩率明显有所改善。对亲代染毒后子代仔鼠早期发育状况进行观察发现MMC+LBP组仔鼠出生体重明显低于正常CON仔鼠出生体重（P＜0.01），其毛发长出时间、开眼时间和自主采食时间与CON和LBP组有显著差异，但耳廓分离时间未见显著差异。CON和LBP组生育能力及其仔鼠早期发育未见显著差异性，表明LBP在一定剂量范围内，未见不良作用，并能全面改善MMC染毒鼠的生殖发育健康状况，另，发现已受孕的正常母鼠哺乳染毒仔鼠，可使其终止妊娠，不生育。有研究表明体内摄入的汞可以随代谢产物随尿液、粪便排出体外，母鼠可能接触到仔鼠毛，尿液以及粪便中的汞而染毒，可致其终止妊娠；MMC+ LBP组，母鼠有生育，且仔鼠能存活，表明LBP有保护染毒鼠的生育能力。通过筛选天然药效成分，研究其对环境因素慢性暴露引起的发育和生殖的损伤后干预作用，将为预防环境污染提供了新的途径，也为枸杞对抗环境污染，提供了理论依据。

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（2013-05-12收稿）

The Intervention Effect of Lycium Barbarum Polysaccharide on Adulthood Lower Fertility Reproduction Induced by Neonatal Exposed to Methylmercury Chloride in Rats

Cao Chi1，Liu Xiang1，Chen Haibin1，Luo Mai1，Cui Jing1，Zhang Hua2，Wang Mijia1，Wang Dan1，Tian Jianying1
（1 Basic School of Medicine，Ningxia Medical University，Yingchuan 750004，China；2 Department of Neurology，Ningxia Autonomous People′s Hospital，Yingchuan 750004，China）

Objective：To detect the toxicity of neonatal exposed tomethylmercury chloride on the adulthood reproduction，aswell as early growth and development in rats and the intervention of Lycium barbarum polysaccharide.Methods：Sixty SD of7 d ratswere randomly divided into saline Control，MMC，MMC+LBP，LBP.The natural development，weight growth and fertilities were observed.Healthy pregnant female rats and MMC exposed neonatal rats and were also observed.Results：1）Compared with the control group，the rats in MMC group was dropping，inactivity，loss of appetite；2）Theweights of rats in MMC group grew slower than in control ratswith the exposure time dependently；3）MMC group were infertility after exposure to themethylmercury.There remained offspring in MMC+LBP group and their after-born death rateswere higher than that of the control group，with low birth weights and low survival rates；4）The weights in MMC+LBP ratswere significant lower（P＜0.01）than that in in control and LBP group；5）The MMC exposed pups influenced the next reproduction of the female rats.Conclusion：Methylmercury chloride has developmentand reproductive toxicity effects on rats.Lycium barbarum polysaccharides have potential protection against the toxicity roles.

Methylmercury chloride；Lycium barbarum polysaccharide；Reproductive toxicity

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.12.029

国家自然科学基金（编号：81060231，81160338）；宁夏高校科技研究重点项目（编号：NGY2011039）

田建英，E-mail：jianyingt＠hotmail.com