增液汤干预干燥综合征模型鼠AQP1／AQP8的表达规律研究

吴晓丹任长虹张 林周洪伟程 涓杨 勇

（1北京中医药大学，北京，100029；2首都医科大学宣武医院，北京，100053；3中国中医科学院，北京，100700；4北京中医药大学东直门医院，北京，101121）

增液汤干预干燥综合征模型鼠AQP1／AQP8的表达规律研究

吴晓丹1任长虹2张 林1周洪伟3程 涓4杨 勇1

（1北京中医药大学，北京，100029；2首都医科大学宣武医院，北京，100053；3中国中医科学院，北京，100700；4北京中医药大学东直门医院，北京，101121）

目的：观察增液汤干预下干燥综合征（Sjogren＇s Syndrome，SS）模型小鼠肺及结肠组织中水通道蛋白AQP1（aquaporin1）、AQP8（aquaporin8）的表达规律。方法：选用BALB／c小鼠，各组10只，免疫诱导法建立干燥综合征小鼠模型，产生SS特异性临床表现和病理改变，采用免疫组化和Western blot蛋白质印迹法观察增液汤对SS模型小鼠肺及结肠组织中AQP1／AQP8表达的影响。结果：增液汤可以增强肺及结肠组织中AQP1的蛋白表达（P＜0.01），对AQP8无影响。结论：AQP1在干燥综合征模型鼠多组织中的表达下调，可能是干燥综合征水液代谢障碍，多脏器损伤的机制之一；增液汤恢复机体阴液，起到“增水”功效可能与上调AQP1蛋白表达有关。

AQP1；AQP8；干燥综合征；Western blot；增液汤

干燥综合征（sjogren＇s syndrome，SS）是一种慢性自身免疫性疾病，以进行性腺体分泌减少为主要临床表现，同时会累及身体多脏器出现炎性改变及功能受损。水通道蛋白的表达减少是干燥综合征重要的发病机制之一［1］，为验证增液汤对干燥综合征患者的整体治疗作用，有必要观察其是否能通过调节水通道蛋白表达而减轻干燥综合征模型的多脏器水液代谢障碍。因此本研究采用免疫组化和Western blot蛋白质印迹法，探索性地观察增液汤对SS小鼠模型肺及结肠组织AQP1和AQP8表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用BALB／c小鼠50只，雌性，SPF级，8～10周龄，体质量20 g左右，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证：SCXK（京）2012-0001。分笼饲养，自由饮水，室温（20±2）℃，湿度55%～60%。

1.2 实验试剂及药物 AQP1抗体（abcam公司，批号：ab11025）；AQP8抗体（sigma公司，批号：WH0000343M1）；弗氏完全佐剂；Tripure蛋白提取试剂盒购自美国Santa Cruz公司；考马斯亮蓝G-250（南京建成生物工程研究所，20110510）；二甲苯（北京益利精细化学品有限公司，20120822）；苏木素染色液、伊红染色液（天合力恩化学试剂，20120907，20120603）；石蜡；中性树脂；二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；百白破联合疫苗（武汉生物制品研究所有限责任公司，20111258-2）。增液汤药物（生地黄、玄参、麦冬）购自北京同仁堂药店，依据新版药典规定HPLC测定药物成分；水煎液组上药加8～10倍水浸泡30 min，煎煮2次，每次40 min，合并滤液，浓缩成1∶1药液，4℃冰箱保存备用，临用时用蒸馏水配成40%溶液。重组人干扰素α2b注射液（北京凯因科技股份有限公司，20110571）。

1.3 实验仪器设备 ASP300自动脱水机（德国LEICA公司）；RM2135切片机（德国LEICA公司）；EG1140H石蜡烤片机（德国LEICA公司）；BX60显微镜（日本OLYMPUS公司）；SPOT-Ⅱ图像分析系统（美国diagnostic instruments Inc.）；低温高速离心机（美国，Beckman）；Dolphin-View凝胶成像系统（美国，Wealtec）；分光光度仪；-70℃低温冰箱；垂直板电泳转移装置。

1.4 动物模型的建立 选用BALB／c小鼠50只，随机分为5组，每组10只，模型组及给药各组分别注射百日咳疫苗+完全弗氏佐剂+同种鼠下颌下腺抗原（200μg／mL），多点注射于小鼠足垫、背部皮下，总量为0.5 mL，腹部注射百日咳疫苗0.05 mL；佐剂组注射CFA，0.1 mL／只脚掌；空白对照组不作任何处理。观察35 d后造模各组出现饮水量增加，唾液流率减少等SS特异性病变后，中药组开始每日灌服增液汤（0.2 mL／10 g）；空白组灌服与中药等体积蒸馏水；干扰素组腹腔注射重组人干扰素α2b注射液。各组给药15 d后，小鼠脱颈椎处死，立即取肺及结肠组织，经4%多聚甲醛溶液固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察；免疫组化检测AQP1、AQP8的定位表达；其余标本置于-70℃冰箱中备用，作Western blot蛋白质印迹分析。

1.5 免疫组化研究 取出组织冷冻切片，0.1 mol／L PBS洗涤5 min×2次；置于0.3%甲醇过氧化氢溶液，室温孵育20 min；PBS浸泡5 min，加封闭血清1 h；加一抗（AQP1、AQP8抗体稀释度分别为1∶500和1∶400），37℃孵育1 h；PBS洗5 min×3次，加生物素化兔抗山羊IgG，37℃孵育1 h；PBS洗5 min×3次，加辣根酶标记链霉卵白素，37℃孵育1 h；PBS洗5min× 3次，DAB显色、冲洗、封片。对照设置：不加一抗为阴性对照。结果判定：棕黄或棕褐色颗粒判定为阳性。染色强度评分标准：阳性细胞百分数＜5%、未被染色为阴性，计0分；5%～15%、浅棕色为弱阳性，计1分；15%～25%、浅棕色为中阳性，计2分；＞25%棕色为阳性，计3分。

1.6 Western blot蛋白质印迹分析

1.6.1 组织总蛋白提取 称取-70℃冰箱保存的各组标本100 mg，分别置于5 mL离心管中，各加入1 mL Tripure裂解液，以Lowry法测定蛋白浓度，转移上清置于-20℃冰箱备用。

1.6.2 蛋白定量 1）制定标准曲线：将中分子量标准蛋白稀释如下：0、50、100、150、200和250μg／mL，各取200μL，紫外可见分光光度计测吸光度。以蛋白标准浓度、吸光度值为横、纵坐标，绘制标准曲线。2）测样本浓度：将提取的蛋白溶液25μL稀释8倍至200μL，得到相应的吸光度值。将待测标本吸光度值在标准曲线上查出其对应的浓度，乘以适当稀释倍数即为样本浓度。

1.6.3 蛋白质印迹测定方法和步骤 分别取样本提取液并加上样缓冲液各15μL混合，取标准蛋白加200 μL上样缓冲液，煮沸5 min；加样（提取液加入总蛋白30μg，标准蛋白加入5μg），缓冲液封闭，60 V电压进行SDS-PAGE电泳5 h；转膜；15 V电压转膜40 min；将PVDF膜置于1%BSA中封闭，4℃冰箱中过夜；倒出1% BSA后，加一抗（AQP1、AQP8稀释度均为1∶1000）置于37℃中1 h；PBS洗涤5 min×3次，加生物素化兔抗羊IgG3μg／mL，37℃摇床1 h；PBS洗涤5 min×3次，加辣根素标记链亲合素3μg／mL，37℃摇床1 h；DAB显色，凝胶成像系统拍照，以β-actin作为内参照。

1.7 统计学分析 采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，各组数据用（±s）表示，组间比较使用Student t test，以P＜0.05和P＜0.01均表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 增液汤对SS模型病理组织学影响

图1 肠组织病理学改变

图1中空白组结肠组织无淋巴细胞浸润，形态正常；SS模型鼠结肠固有层淋巴细胞浸润明显，灶片状淋巴组织增生；增液汤组结肠固有层仅有散在淋巴细胞浸润。

图2 肺组织病理学改变

图2中空白组肺组织形态基本正常；SS模型肺组织出现轻度胸膜炎，周围肺组织出现重度间质炎，部分出现肺气肿表现；增液汤组上述病理改变明显减轻。

2.2 增液汤对SS模型免疫组化的影响

2.2.1 SS模型肺组织AQP1免疫组化结果

图3 -8 肺组织AQP1免疫组织化学结果

图9 -11 结肠组织AQP1免疫组织化学结果

图5显示SS模型肺泡及毛细血管AQP1表达减少，与空白组（图3）比较差异无统计学意义（P＞0.05）；佐剂组与干扰素组（图4、图6）AQP1表达略有增强，与空白组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；增液汤组（图7、图8）AQP1分布均匀，与空白组比较表达明显增强（P＜0.01）。

2.2.2 SS模型结肠组织AQP1免疫组化结果

增液汤组（图11）AQP1分布均匀，表达较空白组（图9）增强（P＜0.05）；模型组（图10）表达未见增强，与空白组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2.3 SS模型肺及结肠组织AQP8免疫组化结果

图12 -17 肺及结肠组织AQP8免疫组织化学结果

如图12-17所示，AQP8在肺及结肠组织的表达明显，分布均匀，但各组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。

图18 （1空白组；2模型组；3佐剂组；4干扰素组；5增液汤组）

图19 （1空白组；2模型组；3佐剂组；4干扰素组；5增液汤组）

2.3 Western blot印迹分析 采用Western blot印迹分析，结果显示与免疫组化基本一致（图18、图19）。在肺组织中，与模型组（灰度值0.785±0.182）比较，增液汤组AQP1（灰度值3.795±0.634）表达明显增强（P＜0.01）；AQP8各组表达差异无统计学意义（P＞0.05）。结肠组织中，与模型组（灰度值0.925±0.326）比较，增液汤组AQP1（灰度值4.227±1.032）表达明显增强（P＜0.01）；AQP8增液汤组与模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

增液汤在《温病条辨》中治疗温病后期，津亏肠燥证。基于中医理论思考分析，温病首先犯肺，肺为水之上源，通调水道，输布水液，且肺与大肠相表里，所以温病发热会导致肺运转水液功能下降，进而导致肠道津液亏竭。本项目主要探索增液汤对干燥综合征模型水通道蛋白的调节规律，进而证明增液汤对干燥综合征患者的整体治疗作用。结合本方主治证及脏腑表里关联性，对肺及结肠组织中水通道蛋白AQP1及AQP8进行研究。研究结果显示，增液汤干预下AQP1在肺泡毛细血管间及肠上皮细胞表达，与模型组比较表达明显增强（P＜0.01）。AQP8在肺及结肠组织的表达明显，分布均匀，但各组差异无统计学意义（P＞0.05），western blot结果与免疫组化趋同。Towne等［2］发现，小鼠急性肺部腺病毒感染后7～14 d，肺组织中AQP1的表达均显著减少，说明AQP1与肺组织水液运转具有相关性。在近20年的研究中陆续发现了水通道家族（aquaporins，AQPs）中的13种亚型（AQP0-AQP12）［3］。AQP1是在人体分布最广泛的水通道蛋白，在机体的各个组织广泛表达，提示其在维持体内水平衡过程中起重要作用［4］。如果AQP1是增液汤的用靶点，说明增液汤“增水行舟”非独润肠，可同时参与全身多组织的津液调节［5］。同时，肺与结肠组织中AQP1的相关性，是否为“肺与大肠相表里”的联接靶点之一，尚需进一步通过研究验证。我们的研究明确了养阴中药作用于机体的靶点，并深入阐释了“增水行舟”的内涵。

［1］Steinfeld S，Cogan E，King LS，et al.Abnormal distribution of aqparin-5 water channel protein in salivary in glands from Sjogren’s syndrome patients［J］.Lab Invest，2001，81（2）：143-148.

［2］Towne JE，Harrod KS，Krane CM，et al.Decreased Expressionof aquaporin AQP1 and AQP5 in mouse lung after acute viral infection［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2000，22：34-44.

［3］Castle NA.Aquaporins as targets for drug discovery［J］.Drug Discovery Today，2005，10（7）：485.

［4］谭美芸.水通道AQP1的研究进展［J］.中国实用医药，2010，5（9）：241-243.

［5］吴晓丹，孙丽英，马伯艳.《温病条辨》增液汤功效探析［J］.南京中医药大学学报，2007，23（6）：351-352.

（2013-07-17收稿）

Intervention of Zengye Decoction on Expression of Aquaporin-1，8 in the Mice w ith Sjogren’s Syndrome

Wu Xiaodan1，Ren Changhong2，Zang Lin1，Zhou Hongwei3，Cheng Juan3，Yang Yong1
（1 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；2 Xuanwu Hospital of Capital Medical University，Beijing 100053，China；3 China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China；4 Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 101121，China）

Objective：To observe the expressions of AQP1 and AQP8 in lung and colon tissue ofmice with Sjogren＇s syndrome.Methods：Fifty BALB／cmice were randomized into five groups，with10 mice in each group.Themicemodelswith Sjogren＇s syndrome were established by immune inducingmethod.Itwas able to produce the specific clinical symptoms and pathological changes of Sjogren＇s syndrome.The effect of Zengye decoction on the expression of AQP1／AQP8 in lung and colon tissuewas observed by immunohistochemistry and Western blot.Results：Zengye decoction can strengthen the AQP1 protein expression in lung and colon tissue（P＜0.01），however AQP8 was barely changed.Conclusion：It could be one of the causes of Sjogren＇s syndrome that AQP1 expression was reduced inmultiple organ in themice with Sjogren’s syndrome.Zengye decoction can increase the body fluid，and the effectmay be associated with the increased AQP1 expression.

AQP1；AQP8；Sjogren＇s syndrome；Western blot；Zengye decoction

10.3969／j.issn.1673-7202.2013.12.026

国家自然科学基金青年科学基金资助项目（编号：81001495／H2705）

杨勇（1971—），男，北京中医药大学基础医学院方药系副教授，医学博士，研究方向：历代名医组方思想及名方配伍的理论与实验研究

吴晓丹（1978—），女，北京中医药大学基础医学院方药系讲师，医学博士，研究方向：方剂配伍规律及疗效客观化研究