实验豚鼠耳蜗外毛细胞静纤毛束变异的发生率分析*

李胜利 樊小军 尹海荣 朱宏亮

·研究报告·

实验豚鼠耳蜗外毛细胞静纤毛束变异的发生率分析*

李胜利1，2樊小军3尹海荣4朱宏亮2

目的通过观察不同实验豚鼠模型的耳蜗外毛细胞（OHC）静纤毛束变异的发生率，探讨OHC变异发生的可能原因。方法 57只豚鼠给予80 mg·kg-1·d-1庆大霉素连续注射30天（庆大霉素组）；33只豚鼠每天给予8小时96～100 d B SPL的工业噪声连续暴露9天（噪声暴露组）；耳蜗OHC静纤毛束变异母体或父体豚鼠所产仔鼠22只，OHC静纤毛正常父母体豚鼠产仔鼠32只，另以20只正常豚鼠作为对照组。所有实验动物检测ABR和DPOAE后，用光镜和扫描电镜观察豚鼠耳蜗OHC静纤毛束变异情况。结果 耳蜗各回均出现OHC静纤毛束变异，外毛细胞第一排（OHC1）最明显，而噪声暴露组耳蜗第二、三回变异最严重，蜗顶和基底回逐渐变轻，该组动物耳蜗OHC静纤毛束变异的发生率为30.30%；庆大霉素组耳蜗OHC静纤毛束变异发生率为7.02%，以耳蜗基底回较严重，向蜗顶减轻，正常对照组动物耳蜗OHC静纤毛束变异的发生率15.0%；而耳蜗OHC静纤毛束变异的母体豚鼠所产的仔鼠均未发现OHC静纤毛束变异的现象。结论 耳蜗OHC静纤毛束变异并非遗传所致，噪声暴露可能是导致OHC静纤毛束变异的重要因素之一。

耳蜗； 外毛细胞； 静纤毛； 变异

已有英国、日本、美国和中国学者相继发现实验动物中有20%～80%的耳蜗外毛细胞（OHC）静纤毛束变异，多表现为第一排外毛细胞静纤毛束正向或反向转位45°～90°，少数甚至达转位180°，如：日本学者Fujita［1］在金黄地鼠（golden hamsters）、英国学者Comis［2］、Furness［3］和美国研究者Yoshida［4］及中国学者顾之平（1993）［5］、李胜利［6～8］等在豚鼠中多次发现该现象，Curtin等［9］在突变小鼠Celsr1观察到同样现象。耳蜗OHC变异的共同特点是：双侧耳蜗第一排外毛细胞（OHC1）静纤毛束可见明显45°～180°的“W”型转向。耳蜗外毛细胞静纤毛束变异对听功能有一定影响，这些变异的实验动物虽然听性脑干反应无明显改变，但听神经动作电位（compound action potentials，CAP）和耳蜗微音器电位（cochlear microphonic，CM）明显下降［1］，CAP阈值较正常动物升高5～10 dB［4］。鉴于耳蜗OHC静纤毛束变异在各种实验动物出现的普遍性，尤其在豚鼠较多见［3～8，10］，有必要了解耳蜗OHC 静纤毛束变异的原因是遗传因素还是环境因素等，因此，本研究对光镜和扫描电镜观察到耳蜗OHC静纤毛束变异怀孕豚鼠所产仔鼠及庆大霉素耳中毒及噪声致聋实验豚鼠耳蜗OHC静纤毛束变异进行对比分析，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 青年杂色与白色豚鼠，体重350～450 g，耳廓反射正常，雌雄各半，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，各研究动物实验情况及外毛细胞静纤毛束变异动物数见表1。57只豚鼠给予80 mg·kg-1·d-1庆大霉素（山东鲁抗辰欣药业有限公司，国药准字H37021973）连续注射30天（庆大霉素组）；33只豚鼠每天给予8小时96～ 100 dB SPL的工业噪声（由陕西煤矿机械厂风机车间的压缩风机产生）连续暴露9天（噪声暴露组）；取各动物左侧耳蜗2.5%戊二醛固定，扫描电镜观察；右侧耳蜗行光镜观察。

由4只母体和2只父体耳蜗OHC静纤毛束变异豚鼠所生产的仔鼠22只为仔鼠组，观察其耳蜗OHC静纤毛束变异的遗传情况；另选正常父母体豚鼠11窝共生产的32只仔鼠作为对照组；该2组均在3月龄后处死，左侧耳蜗行扫描电镜观察；右侧耳蜗行光镜观察。仔鼠均单笼喂养。仔鼠组和对照组动物谱系图见图1、2。

1.2 实验方法 庆大霉素组在用药30天后、噪声暴露组在噪声暴露9天后、仔鼠组和对照组在3月龄后即刻行ABR及DPOAE检测，然后各组分别完成耳蜗铺片及扫描电镜观察耳蜗。

图1 耳蜗外毛细胞静纤毛束变异的父体或母体豚鼠产仔鼠（仔鼠组）谱系图

图2 正常豚鼠产仔鼠（对照组）谱系图

1.2.1 ABR和DPOAE检测 用美国智听公司Smart EP诱发电位仪检测ABR波Ⅲ反应阈及各波潜伏期，短声刺激率19.30次／秒，由DH49耳机发出。前置放大增益100.0 k，带通滤波100～3 000.0 Hz，叠加560次，DPOAE记录：f2／f1＝1.22，L1＝L2＝65 dB SPL，叠加36次，增益100.0 k，由ER-10B+探头给声和记录。

1.2.2 耳蜗铺片毛细胞观察计数 动物麻醉后断头，取下双侧听泡，暴露出耳蜗，一侧耳蜗在手术显微镜下挑破圆窗和卵圆窗膜，在蜗尖挑一小孔，缓慢灌入0.5%Ag NO3染色液10～20 ml，蒸馏水洗后，注入10%福尔马林，日光下曝光2～4小时后，在手术显微镜下进行耳蜗铺片，40倍镜下以三排外毛细胞占满一个视野进行计数。在奥林巴斯显微镜下，沿基底膜由蜗顶向蜗底连续按显微镜视野来计数外毛细胞，整个基底膜可计数到20～25个显微镜视野，每个视野的直径长度为1 mm，取20个视野绘制耳蜗毛细胞分布图。

毛细胞静纤毛束“W”或“V”字形转向大于45°、转向90°和转向180°即认定为变异，逐个视野连续分回计数出OHC变异的百分率，绘制出耳蜗基底膜各部位的毛细胞变异分布图。

1.2.3 扫描电镜观察 用细钢针挑破耳蜗蜗顶和耳蜗底回圆窗及卵圆窗后，快速灌入2.5 mmol／L戌二醛PBS液，置4℃固定4 h，入1.0 mmol／L锇酸固定2 h，PBS洗涤后在手术显微镜下去除耳蜗骨壳、盖膜及部分血管纹组织，充分暴露出Corti器上的基底膜内外毛细胞。梯度乙醇脱水，临界点干燥，喷金，定位后在SEM上观察。

1.3 统计学方法 采用Microsoft Office Excel录入数据，计算平均值。所有数据用SPSS10.0 for Window软件进行t检验。

2 结果

2.1 组织形态学观察结果

2.1.1 各组豚鼠OHC静纤毛束变异率 各组豚鼠中共19只有耳蜗OHC静纤毛束变异（表1）。

表1 各组实验动物OHC静纤毛束变异率

耳蜗各回均出现OHC静纤毛束变异，外毛细胞第一排（OHC1）最明显；噪声暴露组耳蜗第二、三回变异最严重，蜗顶和基底回逐渐变轻（图1），庆大霉素组耳蜗OHC静纤毛束变异在耳蜗基底回较严重，向蜗顶逐渐减轻（表2）。

2.1.2 OHC1转向角度分布率 OHC静纤毛束“W”型变异表现在：①变形：呈不规整形，多弯曲状变形，“W”角变钝或变狭小，两臂长短不一，间距加宽或变成直弧形；少数呈Ω形。②转位：OHC静纤毛束多数转位90°角，朝向蜗底转位较多，少数朝向蜗尖，常可见连续数个毛细胞90°转向蜗底，亦常见+90°和-90°相向出现，并相互伴随出现，部分OHC静纤毛束“W”形转位达180°角（图3、4）。

噪声暴露组豚鼠耳蜗OHC静纤毛束变异较变形严重，而且转向90°和180°的较多（图3）；而庆大霉素组耳蜗OHC静纤毛束变异转向90°常见，转向180°的较少（表2，图4）。仔鼠组22只未发现耳蜗OHC静纤毛束变异现象（图1）。

2.2 ABR及DPOAE检测结果 OHC静纤毛束变异耳（28耳）ABR反应阈有一定上升（40～50 dB SPL），平均值为38.93±3.56 d B SPL（表3），且ABR波形较散乱、重复性差、波幅衰减较快，但ABR波Ⅰ、Ⅲ潜伏期与正常组相比差异无统计学意义（表3）。OHC静纤毛束变异豚鼠DPOAE幅值与正常组比较差异无统计学意义（P＞0.05）（表4）。

OHC静纤毛束变异组在噪声暴露前的DPOAE幅值与噪声暴露9天后有明显的差异，差异主要出现在中频区，而高频区没有显著差异。噪声暴露前后正常组与变异组DPOAE幅值比较，在4 018 Hz以上频率，没有明显变化，而在504～2 844 Hz，变异组噪声暴露前DPOAE的幅值较正常组略降低，噪声暴露后DPOAE幅值降低更明显，与正常组噪声暴露后比较，DPOAE幅值下降更显著（图5）。

图3 噪声暴露组耳蜗外毛细胞静纤毛束变异的扫描电镜观察 a正常OHC静纤毛束“V”字型0°方向与OHC静纤毛束“V”字形转向180°角；b为噪声损害后OHC缺失及静纤毛束转向90°和180°角；c、d为噪声暴露后OHC及静纤毛束转向45°、90°

图4 庆大霉素中毒组耳蜗外毛细胞静纤毛变异的扫描电镜观察 a为庆大霉素注射30天后，耳蜗OHC静纤毛束“V”字形转向45°和90°角；b为庆大霉素损害后OHC缺失及静纤毛束转向45°和90°角；c、d为庆大霉素注射后OHC消失及静纤毛束转向45°、90°

表2 噪声暴露组和庆大霉素组豚鼠耳蜗各回第一排外毛细胞静纤毛束变异细胞计数平均值

表2 噪声暴露组和庆大霉素组豚鼠耳蜗各回第一排外毛细胞静纤毛束变异细胞计数平均值

组别第一回总数 转向90° 转向180°第二回总数 转向90° 转向180°第三回总数 转向90° 转向180°180°噪声暴露组18.7± 2.06第四回总数 转向90° 转向0.82庆大霉素组12.1± 7.3 14.5± 1.87 4± 0.98 26.0± 4.47 20.4± 1.83 4.9± 2.1 22.8± 3.91 19.6± 3.23 3.6± 1.31 11.0± 0.82 8.5± 2.06 2.0± 0.2± 0.33 8.9± 3.75 3.8± 2.95 16.7± 6.03 13.5± 3.96 3.5± 2.54 15± 1.98 13.7± 1.02 0.6± 0.24 3.4± 0.92 3.2± 0.97

表3 耳蜗外毛细胞静纤毛束正常组与变异组豚鼠ABR反应阈及各波潜伏期和波间期比较

表3 耳蜗外毛细胞静纤毛束正常组与变异组豚鼠ABR反应阈及各波潜伏期和波间期比较

组别动物数（只）耳数ABR反应阈（dB SPL）波潜伏期（ms）Ⅰ ⅢⅠ-Ⅲ波间期（ms）变异组14 28 38.93±6.18 1.29±0.13 2.89±0.23 1.60±0.13正常组14 28 34.29±6.23 1.26±0.08 2.84±0.11 1.58±0.07

表4 耳蜗外毛细胞静纤毛束变异组及正常组豚鼠DPOAE幅值

表4 耳蜗外毛细胞静纤毛束变异组及正常组豚鼠DPOAE幅值

频率（Hz）504 712 1 005 1 470 2 011 2 844 4 018 5 665 8 040正常组14 28 19.07±6.82 18.77±3.72 18.39±4.76 22.92±6.27 18.23±9.77 8.23±8.98 3.32±6.93 23.31±组别动物数（只）耳数（耳）6.43 30.15±4.83变异组14 28 14.06±4.79 14.67±6.57 19.61±6.23 21±4.46 20.33±5.05 10.06±8.22 1.72±4.98 22.11±6.68 29.89±5.52

图5 外毛细胞静纤毛束变异组及正常组噪声暴露前后DPOAE幅值比较

3 讨论

3.1 耳蜗外毛细胞静纤毛束变异的判定标准Furness等［3］观察注射卡那霉素及正常对照组豚鼠耳蜗毛细胞时发现外毛细胞静纤毛束转位的现象，并观察到外毛细胞静纤毛束的“W”形变形约占10%和20%，在其实验豚鼠的出现率为27%，但静纤毛束的顶部连接和与盖膜的接触正常。Fujita［1］综合Comis和Furness等的研究结果［2，3］，提出毛细胞静纤毛束转位和变形的5个特征：①耳蜗第一排OHC普遍出现异常；②OHC静纤毛束的“W”形变形，但静纤毛束的顶部连接和与盖膜的接触正常；③变异的OHC表皮板在正常位置和范围；④双侧耳蜗同时出现异常；⑤耳蜗第一排OHC变异对耳蜗听功能有显著影响。顾之平等［5］发现6只豚鼠中3只有明显耳蜗外毛细胞静纤毛束转变异，均呈双侧性，其变异特点是：①变异呈不规整型，多弯曲状，静纤毛束“W”形的角度变钝、变锐，两臂长短不一或间距加宽等；②转位：正常OHC其“W”形开口的纵轴以蜗轴为中心，放射线之间成很小角度，略向蜗尖倾斜，转位毛细胞由轻度转位至90°改变，左右方向亦不一定。Yoshida等［4］在100只豚鼠中发现24%的动物耳蜗静纤毛束异常和转位，CAP阈值提高5～ 10 dB，他认为毛细胞转位45°为变异标准。McFadden等［11］的研究中栗鼠正常耳蜗毛细胞第一排外毛细胞约有50%的静纤毛束转位，但他们认为是正常的耳蜗形态［7］。Curtin等在突变Celsrl1小鼠中发现胚胎和成年动物耳蜗顶回3.6%、底回1.68%的OHC静纤毛束转向，认为是该动物突变的表型［9］。李胜利等［7］发现8只豚鼠中耳蜗外毛细胞多数转位90°角，朝向蜗底方向转位较多，少数朝向蜗顶方向转位，个别转位达180°。可见，上述各研究者对OHC静纤毛束转向角度的认定差异较大，由20°～180°不等，但以45°和90°较多；OHC静纤毛束变异的百分率各家差异也较大，由10%～70%不等；但所有研究者基本认定OHC1静纤毛束变异或转向最多。综上所述，结合本实验结果，认为耳蜗OHC静纤毛束变异的判断标准为：①超过10%的第一排外毛细胞静纤毛束的“W”形变形及转位毛细胞由45°转位至90°角改变，多向基底方向，且呈双侧性。②OHC静纤毛束转位变异程度：Ⅰ型：50%的OHC静纤毛束变异为重度变异；Ⅱ型：30%的OHC静纤毛束变异为中度变异；Ⅲ型：10%以上的OHC静纤毛束变异为轻度变异。③耳蜗毛细胞静纤毛束变异动物的双耳听功能改变。

3.2 耳蜗外毛细胞静纤毛束变异的原因 从文中结果看，噪声暴露组豚鼠耳蜗OHC静纤毛束变异的出现率较高，达到30.30%；而庆大霉素组仅为7. 02%，低于正常对照组的15.0%。耳蜗OHC静纤毛束变异的细胞计数亦可见噪声暴露组豚鼠耳蜗OHC静纤毛束变异的数较多，而且变异细胞转向180°的较多，变异程度较庆大霉素组重。但母体变异者所生下的仔鼠未发现耳蜗OHC静纤毛束变异的现象，说明噪声导致耳蜗OHC静纤毛束变异的发生可能与遗传无关，与Wenngrn等［12］、顾之平［5］和孙建和等［10］关于耳蜗OHC静纤毛束变异是由于遗传变异引起的观点不一致。

本实验中正常豚鼠耳蜗的OHC静纤毛束变异发生率为6.25%，而在2002年的研究［6］中耳蜗OHC静纤毛束变异的发生率是40%，庆大霉素耳中毒组仅为7.02%，2005年［7］的实验中庆大霉素注射后耳蜗OHC静纤毛束变异发生率为16.7%，差异较大，可能与实验动物种群不同有关。

Yoshida和Liberman（1999）发现在三次噪声暴露的实验豚鼠中，耳蜗OHC静纤毛束变异的发生率在14%到33%之间，顾之平和Goodwin（1993）发现单耳较短时间（45分钟）中等强度白噪声（75 dB A）刺激过程中6只白色豚鼠中3只有明显的外毛细胞静纤毛束变异。孙建和等［9］噪声暴露实验中187只豚鼠均无耳蜗OHC静纤毛束的转位。这可能与噪声暴露的类型及强度和时间差异有关。

Dabdoub等［13］的研究证明Wnt信号蛋白对毛细胞静纤毛束定向发育起作用，而Wnt信号蛋白的破坏导致耳蜗毛细胞静纤毛束定向的缺乏，可使三排外毛细胞和内毛细胞静纤毛束变异，他认为这种现象与Fujita［1］、Comis［2］、Furness［3］和Yoshida［4］等观察到的耳蜗第一排外毛细胞静纤毛束变异是一致的，可导致听敏度明显下降。耳蜗毛细胞纤毛的结构、运转机制、发育过程与非经典Wnt／平面细胞极性（PCP）通路之间有密切联系，肌动蛋白解聚作用与PCP相关蛋白对毛细胞纤毛发育和功能有影响，但这种影响在耳蜗毛细胞静纤毛束定向发生变异的三排外毛细胞均出现，Curtin等［9］在突变小鼠Celsr1观察到同样的现象。而本实验和Furness［3］、Yoshida［4］、顾之平［5］和孙建和等［10］发现豚鼠耳蜗外毛细胞变异均发生在第一排，认为这种变异完全不同于Wnt信号和基因突变导致耳蜗三排OHC静纤毛束定向发育异常的表型，耳蜗第一排OHC静纤毛束变异是环境因素造成的可能性较大。

1 Fujita H.Mutant golden hamsters with an abnormal outer hair cell sterociliary arrangement［J］.Hear Res，1990，44：63.

2 Comis SD，Pickles JO，Osborne MP，et al.Tip-link organization in anomalously-oriented hair cells of the guinea pig cochlea［J］.Hear Res，1989，40：205.

3 Furness DN，Hackney CM，Hynd AN.Rotated stereociliary bundles and their relationship with the tectorial in the guinea pig cochlea［J］.Acta Otolaryngol，（Stockh），1990，109：66.

4 Yoshida N，Liberman MC.Stereociliary anomaly in the guinea pig：effects of hair bundle rotation on cochlear［J］.Hear Res，1999，131：29.

5 顾之平，Goodwin J.豚鼠耳蜗毛细胞静纤毛束变异［J］.中华耳鼻咽喉科杂志，1993，28：82.

6 李胜利，朱宏亮，刘晖，等.耳蜗外毛细胞静纤毛束变异与听功能改变的关系［J］.听力学及言语疾病杂志，2002，10：91.

7 李胜利，闫利英，郑庆印，等.耳蜗外毛细胞静纤毛束变异的判定标准与抵抗耳中毒的能力［J］.听力学及言语疾病杂志，2005，13：256.

8 Li Sl，Zhang SQ，Liu SW，et al.Assessment criteria for rotated stereociliary bundles in the guinea pig cochlea［J］.Otol Neurotol，2008，29：86.

9 Curtin JCA，Quint E，Tsipouri，et al.Mutation of celsr1 disrupts planar polarity of inner ear hair cells and causes severe neural tube defects in the mouse［J］.Current Biology，2003，13：1 129.

10 孙建和，胡吟燕，翟所强，等.豚鼠耳蜗毛细胞静纤毛束变异的扫描电镜观察［J］.电子显微学报，2006，25（增刊）：237.

11 McFadden SL，Ding DL，Jiang H Y，et al.Chinchilla models of selective cochlear hair cell loss［J］.Hearing Research，2002，174：230.

12 Wenngren BI，Anniko M.Alberrant frequency tuning and carly stereociliary derangement in genetic inner ear disease［J］.Acta Otolaryngol，1990，109：202.

13 Dabdoub A，Monohue MJ，Brennan A，et al.Wnt singnaling mediates reorientation of outer hair cell stereociliary bundles in the mammalian cochlea［J］.Development，2003，130：2 375.

（2012-09-03收稿）

（本文编辑 李翠娥）

10.3969／j.issn.1006-7299.2013.04.023

时间：2013-3-11 10：03

R764.35

A

1006-7299（2013）04-0403-04

* 国家自然科学基金面上项目（39970785，81170922）、主任基金项目（30440080）联合资助

1 西安交通大学医学院第二附属医院科研实验中心（西安710004）； 2 西安交通大学医学院神经科学研究中心； 3 西安交通大学医学院电镜室； 4 宁夏银川市第一人民医院

李胜利（Email：lishengli59＠163.com）

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／42.1391.R.20130311.1003.009.html