内源性过氧化氢诱导上调自发性高血压大鼠肾脏一氧化氮合成酶的表达

姜 谧 刘 敏 尚 健 曹鹏宇

(吉林大学第一医院心血管疾病诊疗中心，吉林 长春 130021)

一氧化氮(NO)是一种重要的血管扩张因子，由三种类型的NO合成酶(NOS)合成而来:内皮型NOS(eNOS)，神经型NOS(nNOS)和诱导型 NOS(iNOS)〔1〕。自发性高血压大鼠(SHR)体内血管和肾脏的eNOS和nNOS的表达明显高于正常血压大鼠(WKY)〔2〕。SHR体内NOS的活性和NO的产量显著升高〔3〕，而且NOS阻断剂可以明显升高SHR的血压〔4〕。可见，SHR体内由NO介导的血管扩张应答被显著削弱〔5〕。氧化压力(OS)与多种病理生理状态相关联。本文通过探讨OS在肾脏NOS表达调节过程中的作用，旨在分析apocynin与tempol对SHR和WKY肾脏NOS表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物实验与分组 5周龄的SHR和WKY大鼠，随机分成三组:对照组、apocynin、tempol组，每组10只，皆喂食标准食，但饮水分别为:普通水，apocynin投药水(2 mmol/L)，tempol投药水(2 mmol/L)。共计8 w，动物饲养和试验条件都符合动物实验的伦理要求。

1.2 方法

1.2.1 血压与血浆、尿液标本的采集 试验开始和结束分别用尾静脉tail-cuff法测定大鼠的收缩压(SBP)，机器型号:Model UR-5000Ueda，Tokyo，Japan。试验结束的前1 d，大鼠分别进行24 h的代谢笼试验，以获取24 h的尿量和尿液标本。试验最后1 d，断头取血，离心机1 500 r/min，5 min，取上清液血浆于－80℃冰箱保存。

1.2.2 血浆及尿液标本的生化指标测定 肌酐(Scr)，尿素氮指标(BUN)，过氧化氢(H2O2)含量应用试剂盒 Amplex Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit(Molecular Probes，Eugene，Oregon，USA)进行测定〔6〕。NO 体内代谢总产物(NOx)通过格里斯试剂法，应用试剂盒Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay kit(Cayman Chemical Company，Anna Arbor，Michigan，USA)进行测定〔7〕。

1.2.3 组织分离与免疫测定 断头取血后，肾脏和大动脉迅速的被摘取剥离，然后肾脏进一步分离为皮质、髓质外层和髓质内层三部分。制作组织匀浆，高速离心机分离，取上清液于－80℃冰箱保存。组织样本的蛋白含量测定参照 Bradford method〔8〕。NADPH氧化酶活性作为O2-生成量的指标，通过光泽精化学光反应法进行测定〔9〕。肾脏皮质、髓质外层、髓质内层及大动脉的eNOS和nNOS的蛋白表达量，通过Western印迹免疫印迹法进行测定，以对照组蛋白表达量设为1，其他组别的浓度与之比较，应用Image J软件算出。

1.3 统计学方法 应用SPSS16.0统计软件进行分析，数据表达形式为数据分析应用方差分析法，多组之间采用多因素分析的t检验。

2 结果

2.1 各组大鼠血压、生化指标比较 SHR对照组的收缩压(SBP)，血浆及尿液的H2O2和NOx含量都明显高于WKY对照组(P＜0.01);但两组间的Scr和BUN含量，以及肌酐清除率没有明显的差异。SHR，apocynin和tempol都明显降低SBP;其中，tempol投药组比SHR对照组的Scr明显减少，肌酐清除率明显增加，而apocynin投药组和SHR对照组相比则没有变化;apocynin显著降低血浆及尿液H2O2和NOx的含量，而tempol则与其相反，显著增加其含量。WKY大鼠中，无论apocynin还是tempol对SBP及血浆尿液的生化指标都没有显著影响。见表1。

2.2 各组大鼠肾组织NADPH氧反酶活性比较 SHR对照组较WKY对照组肾脏皮质及髓质外层的NADPH氧化酶活性水平都有显著增加〔皮质:(27 743±507)vs(6 720±339)counts/min per mg protein，髓质外层:(21 038±513)vs(6 326±343)counts/min per mg protein(P＜0.01)〕。随之内层的NADPH氧化酶活性没有被测出。SHR中，apocynin和tempol都分别显著降低了肾脏皮质(72%和56%)及外髓质(71%和55%)NADPH氧化酶活性水平;WKY大鼠中，只有apocynin显著降低了肾脏皮质(48%)及外髓质(43%)水平。

2.3 各组大鼠肾组织eNOS、nNOS、硝基酪氨酸水平比较SHR对照组和WKY对照组比较，无论是eNOS，nNOS还是硝基酪氨酸，其在肾脏皮质、髓质外层、髓质内层、大动脉的表达都显著升高。把WKY作为对照组，免疫印迹浓度设定为1.0，SHR肾组织各层eNOS水平:肾脏皮质:1.59±0.046，髓质外层:1.39±0.038，髓质内层:1.42±0.043，大动脉:1.35±0.032;nNOS水平:肾脏皮质:1.41±0.026，髓质外层:1.37±0.028，髓质内层:1.44±0.031，大动脉:1.31±0.026;硝基酪氨酸水平:肾脏皮质:1.56±0.037，髓质外层:1.58±0.045，髓质内层:1.64±0.042，大动脉:1.55±0.033。apocynin显著降低SHR的eNOS和nNOS表达(以对照组的免疫印迹浓度设定为1.0，eNOS水平:肾脏皮质:0.62±0.028，髓质外层:0.71±0.032，髓质内层:0.75±0.038，大动脉:0.69±0.031;nNOS水平:肾脏皮质:0.61±0.029，髓质外层:0.76±0.033，髓质内层:0.78±0.027，大动脉:0.71±0.029)。而tempol则与之相反，显著提高其表达(以对照组的免疫印迹浓度设定为1.0，eNOS水平:肾脏皮质:1.55±0.042，髓质外层:1.57±0.048，髓质内层:1.71±0.047，大动脉:1.59±0.047;nNOS水平:肾脏皮质:1.58±0.045，髓质外层:1.43±0.041，髓质内层:1.64±0.045，大动脉:1.42±0.046)。而对于WKY大鼠，apocynin和tempol都没有明显作用。SHR中，apocynin和tempol都显著降低肾脏皮质、髓质外层、髓质内层、大动脉硝基酪氨酸的表达(以对照组的免疫印迹浓度设定为1.0，apocynin组肾脏皮质:0.49±0.026，髓质外层:0.52±0.039，髓质内层:0.48±0.037，大动脉:0.47±0.028，tempol组肾脏皮质:0.52±0.033，髓质外层:0.53±0.042，髓质内层:0.51±0.039，大动脉:0.49±0.035)。而在WKY大鼠中，仅apocynin显著降低其表达(以对照组的免疫印迹浓度设定为1.0，apocynin组肾脏皮质:0.64±0.041，髓质外层:0.71±0.041，髓质内层:0.67±0.036，大动脉:0.72±0.034;tempol组无变化)。

表1 apocynin和tempol对SHR和WKY大鼠血压及生化指标的影响，n=6)

表1 apocynin和tempol对SHR和WKY大鼠血压及生化指标的影响，n=6)

与对照组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01

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3 讨论

结果显示:虽然apocynin和tempol对于SHR，都有降低血压、抑制肾脏NADPH氧化酶活性和减少肾脏硝基酪氨酸表达的作用，但二者在H2O2和NO终产物以及肾脏NOS表达水平上的作用效果却是相反的。相比于SHR，无论是apocynin还是tempol对WKY基本没有明显的作用。

NADPH氧化酶是高血压发病进程中最主要的超氧负离子O2-的来源〔10〕。O2-和NO反应生成 ONOO-，一方面导致 NO 活性的失活和其进一步扩血管作用的减弱;另一方面，ONOO-与酪氨酸结合生成诱导组织损伤的硝基酪氨酸〔11〕。所以，硝基酪氨酸水平被用来作为ONOO-生成量的指标。本研究结果中，SHR升高的肾脏皮质和髓质NADPH氧化酶活性，血浆和尿H2O2含量，以及肾脏和大动脉硝基酪氨酸水平等都与以往先前的研究结果相一致〔3〕。此外，先前的研究也有报道，SHR肾脏皮质、髓质的过氧化氢酶和谷胱甘肽的含量，并没有明显高于 WKY〔3，10〕。由此可见，SHR体内升高的肾脏 ROS水平，可能主要来源于NADPH氧化酶产生的超氧阴离子。

有研究也表明，长期的apocynin治疗，具有降低SHR血压和抑制NADPH氧化酶活性水平的功效〔3，12〕;急性或长期tempol治疗可以通过将O2-代谢成水的作用，起到对SHR降压和降低NADPH氧化酶活性的作用〔13〕。本研究更发现升高的SHR肾脏和大动脉的硝基酪氨酸水平，通过apocynin或tempol治疗而得以改善。可见apocynin和tempol的抗高血压作用，主要通过降低超氧阴离子的产生和改善超氧阴离子诱导的NO失活而实现。尽管apocynin和tempol在SHR的NOS表达和NO生成量，以及血浆和尿的过氧化氢含量的作用上正好相反，但无论是apocynin还是tempol并不影响WKY体内过氧化氢和NOx含量以及NOS表达水平。因此，apocynin和tempol影响NOS表达和NO生成量，具有对体内高氧化应激状态的SHR选择特异性。

目前为止，本文是第一个对比apocynin和tempol对SHR大鼠肾脏NOS表达效果的研究。虽然先前有抗氧化剂lazanoid缓解SHR体内组织上调的NOS表达的报道〔14〕，但本文的结果中:apocynin降低SHR肾脏各部分NO的生成量和NOS表达水平却和以往其他的apocynin研究不尽相同。以往，有研究显示，4 w的apocynin治疗可以增加SHR大动脉NOS的活性〔15〕，3 w的apocynin治疗可以恢复SHR近肾小球升高的nNOS表达〔16〕，1 w可以减少SHR肠系膜动脉外周血管的NO浓度〔5〕。但也有研究表明6 w的apocynin治疗没有任何效果〔5〕。本研究中，长期的tempol治疗对SHR肾脏各部分组织NOS表达的效果，还是首次被报道。

关于高血压状态下，上调的NOS表达水平的机制假说有许多种。既包括机械压机学说〔17〕，NO失活理论〔18〕，氧化应激理论〔4〕，也包括过氧化氢诱导学说〔18〕。本研究结果中，虽然apocynin和tempol都降低SHR的血压，抑制肾脏NADPH氧化酶活性和减少硝基酪氨酸水平;但apocynin减少而tempol增加肾脏NOS的表达和NO的生成量。这一对立的效果，无法简单的用机械压力学说(血压)，NO失活理论(ONOO-)，以及肾脏NADPH氧化酶诱导的氧化应激理论来解释。而本研究这一对立的作用效果，却和血浆及尿液H2O2的变化相匹配。因此揭示H2O2可能作为中介介质，上调SHR肾脏NOS的表达。此外，以往的研究报道，2 w的tempol治疗可以增加SHR 17%的肾小球滤过率(GFR)。Tempol增加SHR的GFR，改善肾髓质血流等作用，可能是通过改善NO生物活性而实现的。因为，tempol增加了SHR肾脏过氧化氢诱导的NOS表达，同时减少了超氧阴离子诱导的NO失活。

总之，本研究揭示活性氧簇中的内源性过氧化氢，可能是一种中间媒介，通过其可以诱导SHR肾脏NOS的表达和NO的生成。因此，SOD类抗氧化剂的治疗不仅有降压作用，还有高血压状态下的肾脏保护作用。这些作用主要依赖于心血管系统和肾脏NO生物活性的改善。

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