蒺藜皂苷对人卵巢癌细胞SKOV3增殖的影响

陈志伟 梅庆步 张 琪 许惠玉 郑立红

(齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006)

蒺藜为传统中药，蒺藜科(Zygophylaceae)蒺藜属，植物蒺藜(Tribulus terrestris L.)的干燥成熟果实，性微温，味辛苦，有小毒，主要成分是蒺藜皂苷。蒺藜皂苷具有抗衰老，促进免疫功能增强和降血脂、血压等功效〔1，2〕。近些年发现蒺藜皂苷类成分具有很好的抗肿瘤及诱导细胞凋亡的功效〔3〕。卵巢癌是妇科肿瘤中死亡率最高的疾病之一。目前临床采用肿瘤细胞减灭术与多种化疗方案相结合，但是其5年存活率没有明显改善。临床上常用的治疗卵巢癌的化疗药物副作用较大，而且容易出现耐药问题。本研究通过体外实验探讨蒺藜皂苷对肿瘤细胞生长的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及培养 人卵巢癌细胞株SKOV3(购自于中国科学院上海生物科学研究所)培养于含10%灭活小牛血清、100 U/ml青霉素的RPMI1640(GIBCO公司生产)培养基中，37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.2 主要试剂和仪器 Bax和Bcl-2免疫组化试剂盒，DAB显色剂(武汉博士德有限公司)。环磷酰胺(上海华联制药有限公司生产)。HIMAS-1000病理图文分析系统;流式细胞仪(FACScan，Beckman公司)。蒺藜皂苷(陕西森弗生物技术有限公司，纯度达98%)，应用前以纯净水配成所需浓度。

1.3 MTT法检测细胞活性 取处于对数生长期的细胞，调细胞浓度至1×105个/ml，加入到96孔细胞培养板中，每孔100μl，待细胞贴壁后环磷酰胺组加环磷酰胺100 mg/L，200μl;实验组加入100 mg/L蒺藜皂苷药液200μl，对照组加入等体积的无菌注射用水。在37℃、50%CO2、饱和湿度条件下培养，分别于24、48、72 h终止培养。在培养终止前4 h加入MTT 10μl/孔，继续培养4 h，每孔加入100 g/L SDS100μl终止培养，37℃过夜，全自动酶标仪测定570 nm波长处吸光度A值，计算细胞生长抑制率(IR)。抑制率(%)=(A对照－A试验)/A对照×100%。

1.4 流式细胞术(FCM)检测蒺藜皂苷对卵巢癌细胞周期的影响 取70%冷乙醇固定的细胞样品，用PBS洗2次去除残留的乙醇，加碘化丙锭染液(4℃、避光30 min)，用流式细胞仪检测细胞周期的变化，测定凋亡率。

1.5 免疫组化测定Bcl-2及Bax蛋白表达 取各组对数生长细胞1×105个/ml涂片，3%H2O2室温封闭10 min，PBS冲洗，浸泡于0.01 mol/L枸橼酸缓冲液，高压后冷却至室温。具体按常规SP法操作。Bcl-2、Bax抗体为单克隆抗体(1∶100)，以PBS代替Ⅰ抗作为阴性对照。用Image-ProPlus分析软件进行图像分析，每组涂片取10个视野测定肿瘤细胞Bcl-2和Bax蛋白阳性产物的积分吸光度，取平均值代表Bcl-2和Bax蛋白表达强度，吸光度值越大表示阳性产物表达越强。

1.6 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行分析。计量资料以表示，组间比较采用t检验。计数资料比较用χ2检验。

2 结果

2.1 各组细胞抑制率的比较 与对照组(0)相比，实验组(61.6%)及环磷酰胺组(55.4%)对卵巢癌细胞的增殖具有明显的抑制作用(P＜0.05)。

2.2 各组细胞细胞周期变化的比较 与对照组比较，实验组使卵巢癌细胞的S期细胞比例减小，G1期细胞比例增大(P＜0.05)。见表1。

表1 各组细胞周期变化的比较，%，n=10)

表1 各组细胞周期变化的比较，%，n=10)

与对照组比较:1)P＜0.05;下表同

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2.3 各组细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的比较 与对照组比较，蒺藜皂苷能够降低 Bcl-2蛋白表达(P＜0.05)，增加Bax蛋白表达 (P＜0.01)。见表2，图1。

表2 各组细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的比较，n=10)

表2 各组细胞Bcl-2和Bax蛋白表达的比较，n=10)

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图1 各组Bcl-2和Bax水平比较(免疫组化)

3 讨论

本实验结果显示，蒺藜皂苷对卵巢癌细胞系SKOV-3具有明显抑制作用，能有效诱导细胞凋亡，且蒺藜皂苷诱导的细胞凋亡与下调Bcl-2和上调Bax蛋白调节有关。

研究发现，Bcl-2基因是一种重要的内源性抗凋亡因子。Bcl-2阻止或降解细胞皱缩、DNA裂解和染色质浓缩，在细胞凋亡的早期发挥作用〔4〕。Bcl-2过度表达后可抑制由于兴奋性氨基酸、氧自由基、钙超载等诱发的神经细胞凋亡，阻断细胞色素C(Cyt C)释放，阻止 Caspase 活化，从而抑制凋亡〔5，6〕。Bax 是Bcl-2家族中的促死亡基因，与Bcl-2结合成异二聚体是Bcl-2发挥抗凋亡活动的前提。细胞当外界刺激时，促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之间协同作用，共同决定细胞是否进入凋亡程序〔7〕。

细胞周期紊乱是几乎所有肿瘤的共同特点之一，而许多抗肿瘤药物都可以通过对细胞周期的阻滞作用将肿瘤细胞阻滞在G0/G1期或G2/M期，从而达到抑制肿瘤细胞增殖的作用。

本研究表明蒺藜皂苷能明显抑制卵巢癌细胞的增殖，通过有效增加Bax蛋白和降低 Bcl-2蛋白表达启动细胞凋亡，在肿瘤的治疗领域有着良好的应用前景。

1 李君玲.蒺藜皂苷化学及药理研究概述〔J〕.中医药学刊，2006;24(8):1509-10.

2 孙 端.中药有效成分在抗肿瘤治疗中的应用〔J〕.浙江大学学报:B卷英文版，2008;9(9):585-6.

3 Hye Jin Kin，Jin Chul Kim，Jung Sun Min，et al.Aqueous extract Tribulus terrestris Linn induces cell growth arrest and apoptosis by down-regulating NF-κB signaling in liver cancer cells〔J〕.Ethnopharmacol，2011;136:197-203.

4 Yang LQ，Fang DC，Wang RQ，et al.Effect of NF-kappa B，survivin，Bcl-2 and Caspase-3 on apoptosis of gastric cancer cells induced by tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand〔J〕.World J Gastroenterol，2004;10(1):22-5.

5 Norberg E，Orrenius S，Zhivotovsky B.Mitochondrial regulation of cell death:processing of apoptosis-inducing factor(AIF)〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2010;396(1):95-100.

6 张正茂，王梦华，杨雪梅，等.格尔德霉素对人卵巢癌细胞SKOV3增殖和凋亡的影响及其机制探讨〔J〕.肿瘤，2011;31(10):899-905.

7 Chen S，Cooper M，Jones M，et al.combined activity of oridonin and wogonin in advanced-stage ovarian cancer cells:sensitivity of ovarian cancer cells to photoactive chemicals〔J〕.Cell Biol Toxicol，2011;27(2):133-47.