HHEX基因rs1111875G/A多态性与妊娠糖尿病的关系

何明明，班 博，张 梅，李 萍，孙海玲，潘耀平，王艳萍

(1天津医科大学研究生院，天津300070;2济宁医学院附属医院)

妊娠糖尿病 是指妊娠过程中发生或首次发现的任何程度的糖耐量异常，其发病机制涉及胰岛素分泌缺陷及胰岛素抵抗。目前认为其与2型糖尿病(T2DM)相似，亦是遗传基因和环境因素共同作用的结果。T2DM家族史增加了妊娠妇女发生GDM的风险［1］，GDM妇女产后发生T2DM的风险亦显著升高(RR=7.43)［2］，此均提示 GDM 和T2DM有相同的遗传发病基础。已有研究证实2007年GWAS发现的部分T2DM易感基因与GDM的发病风险增加相关［3，4］，但造血干细胞表达同源盒(HHEX)基因rs1111875与中国人群GDM发病的相关性尚不明确。2010年10月～2012年3月，我们采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCRRFLP)方法对451例妊娠妇女HHEX基因rs1111875的单核苷酸多态性(SNP)进行了检测，旨在探讨其与GDM的相关性及可能的作用机制。(GDM)

1 资料与方法

1.1 临床资料 24～28周妊娠期妇女451例，年龄22～43岁。行75 g口服葡萄糖耐量试验(OGTT)并留取空腹、糖负荷后1 h及2 h血糖，同时采集身高、孕前体质量、血压［收缩压(SBP)、舒张压(DBP)］，并计算孕前 BMI=体质量/身高2(kg/m2)。采用胰岛β细胞分泌功能指数(HOMA-B)和稳态模型胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)评估胰岛β细胞功能及胰岛素抵抗，计算方法:HOMA-B=20×空腹胰岛素(FINS)/(FPG-3.5)，HOMA-IR=FPG×FNS/22.5。采用葡萄糖氧化酶法测定血糖，化学发光法测定血清FINS，在全自动生化分析仪上测定血脂。采用2011年美国糖尿病学会(ADA)诊断标准［空腹血糖(FPG)≥5.1 mmol/L，糖负荷后1 h PG≥10.0 mmol/L，糖负荷后2 h≥8.5 mmol/L，其中1项符合者将被诊断为GDM］［5］。符合诊断标准者(203例)纳入GDM组，不符合者(248例)纳入糖耐量正常(NGT)组，个体间均无血缘关系。排除标准:其他类型糖尿病及其合并妊娠者;肝肾功能不全(丙氨酸转氨酶＞正常上限的2倍，血肌酐＞正常上限的1.2倍)及合并慢性炎性疾病者。所有研究对象均签署知情同意书，研究方案经医院伦理委员会批准。

1.2 HHEX基因rs1111875G/A多态性检测方法受试者禁食8～10 h以上，抽取肘静脉血1 mL抗凝，存放于-20℃冰箱用于提取全血基因组。采用血液基因组提取试剂盒(0.1～1.0 mL)提取DNA(北京天根生化科技有限公司)。引物应用Primer Premer5.0设计，由上海生工生物工程有限公司合成，DL1000 DNA Marker由大连宝生物工程有限公司提供。上游引物序列为5'-AAC ATC TAA ACA AGG GGC AG-3'，下游引物序列为5'-TTT TCC CTT TCA GAC TTG GC-3'。PCR 反应体系为50 μL:PCR Master Mix(2×)25 μL;上游及下游引物(浓度100 μmol/L)各 0.2 μL;模板 DNA 3 μL;ddH2O(nuclease-free)21.8 μL。PCR反应条件:95℃预变性5min，95 ℃变性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1min，35个循环，最后72℃延伸7min。用2%的琼脂糖凝胶进行电泳，Tanon-3500凝胶成像系统观察结果。PCR产物酶切反应体系20 μL:10×NEB-uffer4缓冲液2 μL;PCR 产物 10 μL;100×BSA 为0.2 μL;XbaI 0.5 μL;灭菌双蒸水 7.5 μL。内切酶(XbaI)由北京NEB公司提供。条件:恒温水浴锅37℃水浴5 h。用3%的琼脂糖凝胶进行电泳，Tanon-3500凝胶成像系统观测结果。选取部分PCR产物至生工生物工程(上海)有限公司进行基因测序。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。以Hardy-Weinberg平衡法检验各组基因的平衡代表性。正态分布的计量资料采用±s表示，非正态分布资料经对数转换为正态分布资料后进行分析。组间比较采用方差分析，多重比较采用LSD法。各组间基因型分布及等位基因频率比较采用χ2检验，Logistic回归分析基因与疾病的相关性，并以优势比(OR)表示。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 目的基因扩增、酶切及测序结果 HHEX基因rs1111875位点PCR扩增产物为长583 bp的片段(见图1)。应用XbaI进行酶切，因携带G等位基因的目的片段不含XbaI的酶切位点，所以GG基因型酶切后显示一条片段:583 bp，GA基因型显示三条片段:583 bp、400 bp、183 bp，AA 基因型显示两条片段:400 bp和 183 bp(见图2)。测序结果证实HHEXrs1111875位点有GG、GA、AA三种基因型，且酶切结果符合率为100%。

图1 rs1111875 PCR产物

图2 rs13266634多态性酶切结果

2.2 HHEX基因rs1111875单核苷酸多态性分析rs1111875基因型频率在GDM组和NGT组均符Hardy-Weinberg平衡(P均＞0.05)，提示本研究人群能代表群体分布情况。GDM组GG、GA、AA基因型频率分别为9.9%、42.4%、47.8%，NGT组分别为4.0%、40.7%、55.2%，两组比较，P均 ＜0.05。GDM组G、A等位基因频率分别为31.0%、69.0%，NGT组分别为24.4%、75.6%，两组比较，P＜0.05。G等位基因携带者患GDM的风险是A等位基因的1.40倍(OR=1.395，95%CI为1.040～1.871，P=0.026)。

2.3 HHEX基因rs1111875三种基因型间临床资料及生化指标比较 GG、GA和AA基因型之间，年龄、孕前 BMI、DBP、FPG、2 h PG、TG、TCH 、HDL-C、LDL-C、VLDL-C、HOMA-IR的差异均无统计学意义(P均＞0.05)，其余生化指标比较见表1。

表1 各基因型间生化指标比较(±s)

表1 各基因型间生化指标比较(±s)

注:与GG基因型比较，*P＜0.01;与GA基因型比较，△P＜0.05;FINS、HOMA-B均经对数转换

基因型 n 1 h PG(mmol/L)FINS(mU/L) HOMA-B SBP(mmHg)GG 30 9.7±2.7 2.37±0.30 5.02±0.64 123±13 GA 187 8.9±2.7 2.52±0.27 5.33±0.62 119±11 AA 234 8.3±2.7* 2.52±0.26* 5.37±0.55* 122±12△

2.4 Logistic回归分析GDM发生的危险因素 以是否发生GDM为因变量，以年龄、孕前BMI、舒张压、rs1111875基因型为自变量进行二元Logistic回归分析，结果显示GA基因型患GDM的危险度增加，为AA基因型的1.32倍，但差异无统计学意义(OR=1.320，95%CI为0.838～2.077，P=0.231)，GG基因型者患GDM的风险是AA基因型的4.1倍(OR=4.129，95%CI为 1.589～ 10.731，P=0.004)，且独立于年龄、孕前 BMI、舒张压;年龄增大、孕前BMI升高和DBP升高均为GDM发生的危险因素(OR=1.062～1.387，P 均 ＜0.01)，见表2。

表2 Logistic回归分析GDM的独立危险因素

3 讨论

HHEX基因位于人类10号染色体q23.33长270kb的连锁不平衡区，该区域包括三个基因:胰岛素降解酶(insulin-degrading enzyme，IDE)基因，驱动蛋白家族成员 11(kinesin family member 11，KIF11)基因和 HHEX基因。2007年Slake等［6］发现HHEX-KIF11-IDE区与T2DM有关的基因变异位于HHEX基因的3'端，其中包括rs1111875位点G/A单核苷酸多态性。随后，多项研究证实了HHEX基因rs1111875G/A多态性与T2DM的相关性［7～9］，Cho等［3］和 Lauenborg 等［4］还报道了 HHEX 基因rs1111875单核苷酸多态性与GDM的发病风险升高有关。

本研究显示HHEX基因rs1111875基因型频率分布在GDM组和NGT组明显不同，这提示HHEX基因rs1111875的三种基因型(GG、GA、AA)与山东济宁地区GDM的发生有关。GDM组中G等位基因、GG基因型频率均显著高于NGT组，G等位基因携带者发生GDM的风险是非携带者的1.40倍(OR=1.395，95%CI为1.040～1.871，P=0.026)，提示G等位基因可能是GDM的风险等位基因，HHEX基因rs1111875G/A多态性可能与山东济宁地区GDM有关，此与韩国［3］和丹麦［4］报道的结果相一致。本研究GDM组中GG基因型频率与韩国人群相似［3］(9.9% vs 11.8%)，但 明 显 低 于 丹 麦 人 群［4］(37.6%)，推测基因型频率的不同可能与种族差异及样本量大小有关。Logistic回归分析显示GG基因型为GDM的危险因素，GG基因型携带者患GDM的风险是 AA型的 4.1倍(OR=4.129，95%CI为1.589～10.731，P=0.004)，且独立于年龄、孕前BMI和DBP，这提示携带GG基因型者患GDM的风险将大大增加。

GG基因型与AA基因型相比，1 h PG显著升高(P＜0.01)，而FINS和HOMA-B显著降低(P均＜0.01)，这提示HHEX基因rs1111875的G等位基因使山东济宁地区GDM发病风险升高可能是通过减少胰岛素分泌实现的。HHEX基因编码的转录因子高表达于胚胎和成熟的胰腺中，并参与Wnt信号转导通路，调节胰腺β细胞的生长和功能［10，11］。研究表明敲除该基因后，内胚层上皮细胞增殖受损，最终影响胰腺胚芽的发生与形态［10］。因该部分胰腺是胰多肽产生的部位，因此HHEX单核苷酸多态性可能影响胚胎期或成年期激素的产生，并影响胰岛素的释放。据此推测携带GG基因型可能使胰岛β细胞功能受损，胰岛素分泌减低，进而引起血糖升高。此外，本研究未发现HHEX基因rs1111875G/A多态性与GDM患者胰岛素抵抗存在相关性。

综上所述，HHEX基因rs1111875G/A多态性与山东济宁地区GDM的发生有关，G等位基因可能是其风险等位基因，GG基因型可能与GDM患者胰岛素分泌量减低有关，但其具体机制尚不明确。因此，仍需进一步深入研究HHEX基因rs1111875G/A多态性与GDM发病相关的作用机制。

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