Apelin-13对肾上腹主动脉缩窄诱导的心力衰竭大鼠心肌纤维化的影响

杨 攀，张 志

(1盘锦市中心医院，辽宁盘锦124000;2辽宁医学院附属第三医院)

心肌纤维化(MF)是多种心血管疾病发展到一定阶段的共同病理改变，亦是心室重构的主要表现之一。MF可破坏心肌细胞间的耦联，降低毛细血管密度，增加心肌硬度，致心脏舒张顺应性降低，是心力衰竭发生的重要危险因素［1］。近年研究发现［2］，Apelin/APJ信号系统在心血管系统高度表达，在降低血压、改善心功能、保护心肌细胞、促进血管生成等方面有重要作用。但目前对Apelin在心力衰竭治疗中的作用是否与抑制MF有关尚不清楚。2011年10月～2012年10月，我们通过肾上腹主动脉缩窄法建立大鼠心力衰竭模型，观察外源性给予Apelin-13对大鼠MF的影响，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性SD大鼠40只，体质量220～270(250±10)g，由辽宁医学院动物实验中心提供;常温低速离心机、BioRad图像分析系统、倒置相差电子显微镜;Apelin-13(Sigma公司，美国)，大鼠Apelin-13，TGF-β1、BNP、MMP2、TIMP-1酶联免疫(ELISA)试剂盒(RapidBio Lab，美国)，Masson 染色试剂，辣根过氧化酶标羊抗兔IgG(天津TBD生物技术有限公司)，D-Hanks缓冲液，10%甲醛溶液。

1.2 模型制备及实验方案 将40只大鼠随机分为4组各10只，适应性喂养1周后按文献［3］中的肾上腹主动脉缩窄法建立慢性心力衰竭模型:2%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉，固定，剃毛，打开腹腔并分离腹主动脉，分离组织，用内径0.7 mm银夹造成腹主动脉狭窄，分层关闭腹腔;假手术组仅分离腹主动脉未用银夹夹闭。低剂量Apelin-13组造模同时每天予Apelin-13 1 μg/(kg·d)腹腔注射;高剂量Apelin-13组:造模同时予 Apelin-13 10 μg/(kg·d)腹腔注射;模型组和假手术组腹腔注射生理盐水10 μg/(kg·d)，实验时间均为4周。

1.3 各组血流动力学指标测定 2%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射麻醉各组大鼠，经右颈总动脉插入心导管，用生理仪测定大鼠左心室最大收缩压(LVESP)、左心室舒张末期压(LVEDP)及左心室内最大升降速度(LV±dp/dtmax)。

1.4 血清 TGF-β1、BNP、MMP2、TIMP-1 测定 各组大鼠经右侧颈总动脉插管处采集血液5 mL，以3 000 r/min离心10min，吸取上清液，EP管分装，置于-20℃冰箱保存备用。应用ELISA法检测血清 TGF-β1、BNP、MMP-2、TIMP-1 水平。

1.5 心肌细胞胶原的定性和半定量分析 将各组大鼠开胸取出心脏，取左室中段横截面，4%甲醛固定，脱水，石蜡包埋，切片Masson染色，用光学显微镜检测心肌细胞组织学改变。采用图像分析系统，测量心肌胶原容积分数(CVF)，每张心肌切片标本随机取4个视野测量，取平均值。

1.6 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件，计量数据以±s表示，行t检验，率的比较采用χ2检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

假手术组死亡1只，模型组死亡3只，低剂量Apelin-13组、高剂量 Apelin-13组均死亡2只。各组血流动力学指标检测结果见表1，血清TGF-β1、BNP、MMP-2、TIMP-1水平比较见表2。假手术组、模型组、低剂量Apelin-13组、高剂量 Apelin-13组CVF分别为(7.96±0.44)%、(18.54.±0.86)%、(16.77±0.72)%、(10.23.±0.57)%，假手术组与模型组、低剂量Apelin-13组比较，P＜0.01，与高剂量Apelin-13组比较，P＜0.05;高剂量Apelin-13组与模型组比较，P＜0.01。

3 讨论

目前MF的发生机制仍未完全明确，但大量研究表明［4～6］，神经内分泌系统激活导致的心肌重构及基质金属蛋白酶(MMPs)与组织抑制因子(TIMP)平衡失调导致的胶原合成代谢和降解代谢失衡是MF发生、发展的重要机制。另一方面，临床工作者们发现，ACEI及ARB类神经拮抗剂药物虽然对抑制心肌重构有一定效果，但对MF的效果并不理想，此提示除肾素—血管紧张素(RAS)系统外可能有其他神经内分泌系统参与MF的形成与发展［7］。

表1 各组血流动力学指标比较(±s)

表1 各组血流动力学指标比较(±s)

注:与假手术组比较，*P＜0.01;与模型组比较，△P＜0.01

组别 n LVESP(mmHg) LVEDP(mmHg) LV+dp/dtmax(mmHg/s) LV-dp/dtmax(mmHg/s)模型组 7 79±12* 18.8±4.2* 1 543±148* 1 637±146*低剂量Apelin-13组 8 82±9* 16.9±3.8* 1 702±224* 1 698±221*高剂量Apelin-13组 8 98±14＊△ 9.4±2.4＊△ 2 188±206＊△ 2 078±212＊△假手术组9 114±12 3.9±1.1 3 018±241 2 827±214

表2 各组血清 TGF-β1、BNP、MMP-2、TIMP-1 水平比较(±s)

表2 各组血清 TGF-β1、BNP、MMP-2、TIMP-1 水平比较(±s)

注:与假手术组比较，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01;与低剂量 Apelin-13组比较，#P ＜0.05

组别 n TGF-β1(pg/mL) BNP(pg/mL) MMP-2(μg/L) TIMP-1(μg/L)MMP-2/TIMP-1模型组 10 67.89±3.27＊＊# 42.04±6.62＊＊# 11.78±1.32＊＊# 23.47±2.37＊＊# 0.50±0.06＊＊#低剂量Apelin-13组 10 58.78±2.15＊＊△ 38.76±4.31＊＊△ 13.70±2.14＊＊ 21.15±2.21＊＊△ 0.64±0.05＊＊△高剂量Apelin-13组 10 52.58±2.13△△# 30.28±4.42△△# 20.62±1.19△△# 16.81±1.31△△# 1.23±0.03△△#假手术组 10 45.36±2.08 24.35±2.36 24.31±1.13 12.63±1.08 1.92±0.05

Apelin/APJ信号系统是近年来新发现的信号系统，与RAS系统相似，Apelin/APJ信号系统在心血管系统高度表达，而其生理作用却截然相反。研究表明［8］，在心力衰竭代偿期内机体内源性Apelin表达增加，而在心力衰竭晚期其表达水平则降低。Japp等［9］研究发现，外源性给予Apelin能有效改善各种缺血性及非缺血性心脏病的心功能而不引起心肌肥厚。Apelin在心血管疾病的治疗和预防中可能有更广阔的前景。本研究结果显示，应用肾上腹主动脉缩窄法诱导的心力衰竭大鼠血流动力学发生异常改变，左室肌纤维排列紊乱，可见大量胶原纤维变性，血管周围亦可见反应性纤维化，CVF异常升高。而较大剂量腹腔注射外源性Apelin-13，大鼠血流动力学得到明显改善，CVF有所降低，提示Apelin-13可减轻心肌损伤，有效阻止心肌纤维化。

近年来对Apelin的心脏保护作用机制研究日益增多，Apelin可能通过多种细胞因子和神经内分泌因子参与调节MF的形成和发展。TGF-β1是一种多功能的细胞因子，具有细胞转化作用，其可抑制实质细胞增殖，促进间质细胞增殖及细胞外基质合成［10］。目前，TGF-β1 调节细胞增殖，促进纤维化的作用已得到多数学者认同，关于TGF-β1促进肺纤维化、肾脏纤维化、MF 等均有报道［11～13］。BNP 是近年来研究较多的一种神经内分泌因子，主要由心肌细胞分泌，当心室负荷加重时，BNP生成增加。研究证实BNP与心肌重构密切相关［14］。MMPs能降解细胞外基质，是心肌间质重建中基质降解的重要因素，而TIMPs是MMPs内源性特异性抑制剂。其中TIMP-1与MMP-2关系密切，且在心脏表达较多。本研究结果表明在大鼠心力衰竭模型中TGF-β1、BNP明显升高，证实TGF-β1参与MF的发生与发展，此与大部分学者的研究结果一致，而BNP异常升高表明MF大鼠中存在神经内分泌系统异常。外源性给予Apelin-13后TGF-β1、BNP水平明显降低，MMP-2明显升高，TIMP-1明显降低，MMP-2/TIMP-1接近正常。表明Apelin-13可能通过调节MMP-2/TIMP-1，抑制细胞外基质合成，促进心肌细胞外基质成分降解，抑制心肌重构及MF。

综上所述，外源性给予Apelin-13可改善大鼠血流动力学，有效抑制 TGF-β1、BNP，调节 MMP-2/TIMP-1平衡，抑制MF，发挥心肌保护作用。此对于防治心力衰竭、降低血管疾病的死亡率有重要意义，亦对Apelin-13治疗心脏疾病提供了新的依据。

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