双酚A对雌性大鼠间脑组织Kisspeptin/GnIH基因表达的影响

刘丽霞，殷 宏，田世民，钟 理

(1河北大学研究生学院，河北保定071002;2中国检验检疫科学研究院综合检测中心毒理实验室，质检总局毒理重点实验室)

环境雌激素是指环境中存在的具有雌激素特征的一类内分泌扰乱物质。双酚 A(bisphenol A，BPA)是环境雌激素的一种，为弱雌激素拮抗剂，可结合于雌激素受体上，最终导致机体性别分化的改变、青春期提前、发情周期改变、垂体分泌能力的改变、生殖能力下降等危害［1］。其目前广泛用于罐头食品和饮料的包装、奶瓶及水瓶等塑料日用品及牙封闭剂中［2］。神经生殖内分泌系统主要由下丘脑—垂体—性腺轴(HPG)进行调控。近年来大量实验证明，类固醇激素通过直接作用于新发现的一组神经肽:Kisspeptin及促性腺激素抑制激素(GnIH)，对生殖轴进行调控。2012年3～8月，我们以去卵巢雌性大鼠为动物模型，利用Real-Time PCR方法检测了BPA对大鼠间脑组织中Kisspeptin、GnIH及其各自受体mRNA表达量的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 SPF级成年雌性SD大鼠16只，体质量(200±20)g，购于北京维通利华实验动物有限公司［实验动物许可证编号:SCXK(京)2012-0001］。饲养条件为昼夜12 h交替，室内温度控制于20～25℃，湿度40%～70%，食水自由摄取［实验动物使用许可证号码:SYXK(京)2011-0016］。BPA(日本和光公司);雌二醇(Sigma公司);总RNA提取试剂Trizol(Invitrogen公司);反转录及荧光定量试验使用Promega公司的Go Taq 2-Step RT-qPCR System试剂盒。荧光定量反应所用仪器为Applied Biosystems 7500。

1.2 去卵巢雌性大鼠模型制备、分组及干预 模型制备参照文献［3］，于乙醚麻醉下行卵巢摘除手术，手术结束后动物恢复1周，将其随机分为四组各4只，分别为阴性对照组、BPA低剂量组、BPA高剂量组、雌二醇处理组。BPA高剂量组采用其最大耐受剂量［1 g/kg body weight(BW)·d］的 1/10(100mg/kg BW·d)，低剂量组为高剂量组的1/10。用乙醇溶解BPA后，橄榄油稀释，按照0.5 mL/kg BW·d进行腹腔注射。阴性对照组予橄榄油0.5 mL/kg BW·d，雌二醇处理组予雌二醇1mg/kg BW·d，每日给药1次，连续给药3 d，给药结束1周之后乙醚麻醉下解剖动物，取双角子宫及间脑［4］，剔除多余脂肪组织，称量各脏器的重量，记录并计算脏器系数(脏器重量/体重×100%)。将所取脏器迅速投于液氮中速冻，-80℃保存。脏器重量及脏器系数的结果显示，与去卵巢阴性对照组相比，雌二醇处理组动物子宫的重量及脏器系数显著增加，说明本实验中去卵巢雌性大鼠模型构建成功［3］。

1.3 间脑中 Kisspeptin、GPR54、GnIH 与 GPR147基因mRNA测定方法 按照Trizol法使用说明提取组织总RNA，根据OD260/OD280的值测定RNA的质量，计算总 RNA的浓度。用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水将RNA稀释至终质量浓度100 ng/μL。以上述RNA为模板，Oligo(dT)15为引物进行反转录，反转录体系为20 μL。试验流程按照Promega公司的两步法RT-qPCR试剂盒中的反转录部分进行。相对实时荧光定量PCR实验:内参基因为大鼠β-actin，登录号 NW_048034，引物序列(5'→3')为 F-AGATGACCCAGATCATGTTTGAGA，R-ACCAGAGGCATACAGGGACAA;目的基因分别为大鼠Kisspeptin及其受体 GPR54、大鼠GnIH及其受体GPR147四种基因，其登陆号分别为NW_047395、NW_047773、NW_047691、NW_047601，引物序列(5'→3')分别为:F-ATGATCTCGCTGGCTTCTTGG，RGGTTCACCACAGGTGCCATTTT;F-GCTGGGAGACTTCATGTGCAA，R-AGCGGGAA CACAGTCACATACC;F-GAGTCCTGGTCAAGAGCAAC，R-ACTGGCTGGAGGTTTCCTAT;F-CGCTCCTACCCGCTCTACT，RAGCGGCACCAGGTAGATGT。扩增采用 SYBR Green法，引物设计参考 Quennell等［5］的报告。试验流程按照Promega公司的两步法RT-qPCR试剂盒中的qPCR部分进行。扩增程序为:95℃ 2min，95℃ 15 s，60℃ 1min;40个循环;溶解曲线程序:95 ℃ 15 s，60 ℃ 1min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。相对荧光定量PCR的分析方法为2-△△Ct法。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件，计量数据以±s表示，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

四组动物间脑组织中 Kiss1、GPR54、GnIH与GPR147基因mRNA表达见表1。

表1 四组动物间脑组织中Kiss1、GPR54、GnIH与GPR147基因mRNA表达(±s)

表1 四组动物间脑组织中Kiss1、GPR54、GnIH与GPR147基因mRNA表达(±s)

注:与阴性对照组相比，*P＜0.05，△P＜0.01

组别Kisspeptin GPR54 GnIH GPR147 BPA低剂量组 0.37±0.06△ 1.01±0.15 0.50±0.12△0.70±0.04 BPA高剂量组 0.50±0.20* 1.69±0.24△ 0.90±0.26 1.50±0.53雌二醇处理组 0.26±0.07△ 1.76±0.28△ 0.94±0.16 0.79±0.16阴性对照组1.02±0.24 1.00±0.11 1.03±0.28 1.03±0.30

3 讨论

Kisspeptin是Kiss1基因的后翻译产物之一，大鼠体内的Kisspeptin序列为YNWNSFGLRF，其受体为G蛋白偶联受体GPR54，促性腺激素释放激素(GnRH)神经元表达 GPR54 的 mRNA［6，7］。GnIH 是2000年日本学者从鹌鹑的间脑中分离出的由下丘脑分泌的一种神经肽，氨基酸序列为SIKPSAYLPLRF［8］，其受体(GnIH-r)为 OT7T022/GPR147，在大鼠脑内33%GnRH神经元表达GPR147［9］。实验发现Kisspeptin神经元表达有雌激素受体 ERα［3］，双标记免疫荧光实验证明，约40%GnIH免疫阳性神经元表达 ERα［10］，Kisspeptin能够激活 GnRH 及黄体生成素(LH)的分泌［4，7］，而 GnIH 具有抑制促性腺激素及 LH 分泌的功能［8，11］。

本试验建立了去卵巢雌性大鼠动物模型，以排除动物体内雌激素对试验的干扰。关于雌激素对Kisspeptin/GnIH的影响已有一些报道，Quennell等给去卵巢雌性SD大鼠皮下包埋约含10 μg 17β-estradiol的橡胶管7 d后测定不同脑区内Kisspeptin、GPR54、GnIH和 GPR147的mRNA水平，结果显示与Kisspeptin基因相比，GnIH基因未见与雌激素有关的明显改变［5］。本试验中雌二醇处理组结果与文献报道一致，给去卵巢雌性大鼠雌二醇1mg/kg BW·d腹腔注射，连续给药3 d，大鼠间脑组织内Kisspeptin mRNA水平明显降低，GPR54基因表达明显升高，而GnIH和GPR147基因表达无显著变化。

关于环境雌激素对Kisspeptin/GnIH的影响鲜有报道。本研究给予不同剂量的环境雌激素双酚A，检测了其对间脑内Kisspeptin、GnIH及其各自受体mRNA表达量的变化。对于BPA对Kisspeptin mRNA表达的影响结果显示，BPA低、高剂量组均显著降低了间脑内 Kisspeptin基因的表达量;而GPR54的表达量在BPA高剂量组动物间脑组织中显著升高，低剂量组动物间脑组织中无明显变化。Kisspeptin免疫阳性神经元在啮齿类动物脑中具有两种主要类型，一种存在于弓形核(ARC)，另一种存在于前腹室旁核(AVPV)中［12］。对去除卵巢的雌性小鼠及AcGFP转基因小鼠给予E2，明显增加了AVPV内Kisspeptin基因的表达水平，显著降低了ARC内Kisspeptin基因的表达［13］。由本试验结果可推测在去卵巢雌性大鼠间脑组织内BPA及雌二醇处理对ARC核团中Kiss1表达的抑制作用超过其对AVPV核团中Kisspeptin表达的促进作用。在BPA处理组中，大鼠间脑组织内GnIH mRNA表达量在BPA低剂量组显著降低(P＜0.01)，而在BPA高剂量组无显著变化。

从BPA对Kisspeptin mRNA及GnIH mRNA表达量的影响来看，高剂量BPA比低剂量BPA对二者的影响显著，即BPA的作用具有低剂量效应的特点。在内分泌扰乱物质研究中经常出现的倒U型非单调剂量效应关系(NMDRs)中，低剂量效应常常是人们关注的问题。Vandenberg等［1］提出BPA对机体的干扰作用具有低剂量效应，极低剂量的BPA能够作用于mER、GPR30以及定位于胞质或线粒体上的ERs，刺激一系列“非经典”细胞通路“激活”细胞应答。还有报道指出，在环境相关水平低浓度的BPA对大鼠可以诱导仔鼠跨代遗传的表型异常［14］。

综上所述，BPA能干扰生殖轴中的重要神经肽Kisspeptin及GnIH表达，且其干扰作用具有低剂量效应。而低剂量BPA是否作用于GnIH及Kisspeptin神经元的特殊类型雌激素受体，亦或作用于GnIH及Kisspeptin基因的启动子，影响关键序列的甲基化或乙酰化，从而造成不同于高剂量BPA和雌激素的作用，有待进一步研究确定。

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