固相萃取-HPLC法同时测定肉制品中苋菜红、胭脂红、日落黄和诱惑红的含量

陈连梅

摘?要：建立了利用固相萃取-高效液相色谱法同时测定肉制品中4种合成色素的检测方法。样品经乙醇、氨水和水溶液(7:2:1，m/m)提取后，固相萃取净化，经C18柱分离，用紫外检测器检测。结果表明：4种合成色素分离良好，加标平均回收率为66.7%～99.7%，相对标准偏差1.9%～3.6%。该方法准确度和精密度较高，可应用于测定肉制品中的合成色素。

关键词：合成色素；固相萃取；反相高效液相色谱法

中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123(2013)10-0026-03

合成色素一般以苯、甲醛、萘等为原料，经磺化、卤化、偶氮化等加工而成，有一定毒性和致癌性，但因其成本低廉、色泽鲜艳、着色力强等优点，被广泛使用。GB 2760—2011《食品安全国家标准：食品添加剂使用标准》对常见合成色素的使用进行严格限制。目前现行有效的检测方法[1-3]未涉及肉制品中合成色素的检测，肉制品中胭脂红的检测[4]存在操作繁琐，净化效果差，回收率不稳定等缺点。本实验参考相关文献[5-20]，建立了一套具有前处理简单、净化效果好、回收率稳定等优点的检测方法。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红均购自国家标准物质中心；甲醇(色谱纯)、乙酸铵(色谱纯)均购自Fisher公司；其他试剂均为分析纯；固相萃取柱：P-WAX(60mg/3mL)。

1200高效液相色谱仪 美国Aglient公司；T10均质器 德国IKA公司；VX-Ⅲ平行多管振荡器 北京Targin公司；N1001旋转蒸发仪 日本Eyela公司；V-700真空泵 瑞士Büchi公司；GL-21M高速冷冻离心机 长沙相仪公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：ZORBAX XDB-C18柱(4.6mm×150mm，5?m)；流动相：甲醇-乙酸铵(0.02mol/L)，梯度洗脱(表1)，流速1.0mL/min，检测波长为480nm。柱温30℃；进样量20?L。

1.3 方法

1.3.1 样品提取

称取经处理均匀后的样品2.50g于50mL具塞离心管中，加入10mL乙醇、氨水和水溶液(7:2:1，m/m)溶液，10000r/min均质2min后经平行多管振荡器提取30min，4000r/min离心1min，上清液转移至另一50mL离心管中，残渣用10mL乙醇、氨水和水溶液(7:2:1，m/m)溶液重复提取一次，合并提取液。提取液中加入10mL水饱和正己烷，浓缩至2～3mL，用柠檬酸溶液调pH值至6～7，备用。

1.3.2 样品净化

P-WAX固相萃取柱经3mL甲醇溶液、3mL水活化后，将1.3.1节中的全部样液过柱，依次用3mL纯净水、3mL甲醇溶液淋洗，抽干。用5mL 2%氨水甲醇溶液洗脱，洗脱液转移至旋转蒸发瓶中，40℃蒸干，用1mL纯净水定容后超声溶解，经0.45μm水系微孔滤膜过滤，滤液供高效液相色谱仪测定。

2 结果与分析

2.1 样品预处理方法选择

本试验比较水、乙醇、乙醇氨水作为提取液提取样品中的色素，结果表明乙醇氨水的提取效果最好，在经固相萃取柱净化前须将乙醇挥去，并用柠檬酸溶液调pH值至6～7，否则会降低样品的回收率。

2.2 样品净化选择

GB/T 5009.35—2003《食品中合成色素的测定》中样品的净化存在操作繁琐、回收率不稳定的问题。本实验考虑到合成色素分子结构中均含有磺酸根，选择弱阴离子固相萃取柱净化样品，经试验，Strata-X-AW和Cleanert P-WAX均能达到良好的净化效果。

2.3 流动相选择

分别对甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.02mol/L乙酸铵水溶液、甲醇-0.02mol/L乙酸铵水溶液体系进行试验，目标物在甲醇-水、乙腈-水体系中峰形很差，乙腈-0.02mol/L乙酸铵水溶液、甲醇-0.02mol/L乙酸铵水溶液对目标物的分离效果比较理想，考虑到环保与检测成本，终选择甲醇-0.02mol/L乙酸铵水溶液作为流动相。考虑到将4种物质完全分离，且尽可能地缩短洗脱时间，同时兼顾分离效果和色谱峰形，流动相洗脱程序见表1所示，分离效果如图1所示。

2.4 回归方程、线性范围和检出限

准确吸取一定量的苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红标准储备液，用水配制成混合标准溶液，按1.2节中色谱条件进样，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。采用阴性样品中添加目标化合物的方法，按1.3节中的方法进行前处理，以10倍信噪比为定量限，各组分的回归方程、相关系数、线性范围及定量限列于表2。

2.5 方法的回收率和精密度

分别加入一定量的4种组分标准品，按1.3节中方法进行前处理，1.2节中色谱条件进样，考察方法的回收率和精密度，每组作6组平行实验，样品量为2.50g。从表3中看出，各组分的回收率在66.7%～99.7%之间，相对标准偏差在1.9%～3.6%之间。

3 结?论

本实验建立了同时测定样品中4种合成色素的固相萃取-反相高效液相色谱检测方法。4种组分的检出限为0.06～0.08mg/kg，回收率在66.7%～99.7%之间，相对标准偏差在1.9%～3.6%之间，方法的回收率和精密度均能满足检测需求。通过大量测试样品的检测证实，此方法切实可行，可应用于样品中合成色素的检测。

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