HPLC法测定三叶青中槲皮素和山奈酚含量研究

2015-09-30刘洋钱丽华

安徽农学通报 2015年17期

刘洋+钱丽华

摘要：目的：建立HPLC法测定三叶青中槲皮素和山奈酚的方法。方法：三叶青组培物样品经甲醇超声提取，HLB固相萃取小柱净化，在色谱条件：色谱柱Varian ODS C18（4.6mm×250mm×5μm）、柱温30℃、流动相0.2%磷酸水-甲醇、流速1.0mL/min、检测波长360nm下进行测定。结果：槲皮素和山奈酚的方法检出限和线性范围分别为0.05mg/kg和0.05～50μg/mL，且线性范围内的相关系数均大于0.999 9，加标回收率为71.9%～105.8%，相对标准偏差为1.5%～3.4%。结论：HPLC法结合固相萃取技术可用于测定三叶青中槲皮素和山奈酚的含量，方法检出限低，结果准确可靠，重复性好。

关键词：HPLC；固相萃取；三叶青；槲皮素；山奈酚

中图分类号 R284 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2015）17-26-04

Study on the Determination of Quercetin and Kaempferol in Radix tetrastigmae by High Performance Liquid Chromatography

Liu Yang et al.

（Hangzhou Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310024，China）

Abstract：Objective：A high performance liquid chromatography method for determination of quercetin and kaempferol in Radix tetrastigmae was studied. Method：The samples of tissue cultures were extracted with methanol by ultrasonic and purified with HLB solid phase extraction. Then，the analysis was performed on a Varian ODS C18（4.6mm×250mm×5μm）chromatographic column with methanol and 0.2% phosphoric acid as mobile phase at a flow-rate of 1.0mL/min，the column temperature was 30℃ and the detection wavelength was 360nm.Results：method detection limits for quercetin and kaempferol were both 0.05mg/kg，and good linearity for them over the range of 0.05～50μg/mL（r>0.999 9）. The average recovery and RSD of the method for quercetin and kaempferol were 71.9%～105.8% and 1.5%～3.4%，respectively. Conclusion：high performance liquid chromatography（HPLC）method combined with solid phase extraction technology can be used for the determination of quercetin and kaempferol in Radix tetrastigmae with low method detection limits，high accuracy and good repeatability.

Key words：High performance liquid chromatography；Solid phase extraction；Radix tetrastigmae；Quercetin；Kaempferol

三叶青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）是葡萄科崖爬藤属多年生蔓生藤本植物，为中国特有珍稀中药植物，是一种民间常用的中草药，其性凉味苦，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛的功效[1-2]。化学分析研究发现，三叶青中主要含有槲皮素、山奈酚、崖爬藤甙崖、异崖爬藤甙等黄酮类化合物，同时含有氨基酸类、萜类、强心苷类、甾体类、多糖类、有机酸类、挥发油、油脂以及丰富的微量元素，药理学研究表明，三叶青黄酮类提取物具有抗肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡等的作用[3-4]。目前，鉴于三叶青葫芦块根人工栽培技术瓶颈尚未突破以及野生资源过度采挖造成濒危、被列入了浙江省首批农作物种质资源保护名录品种，利用生物技术来生产三叶青中抗癌黄酮等次生代谢物不失为一条很好的途径。因此，这就需要明确三叶青组培物中黄酮类化合物的含量，为三叶青的质量控制提供理论依据。本文首次采用高效液相色谱法结合固相萃取技术应用于三叶青中槲皮素和山奈酚含量的同时测定，并对三叶青组培物中的含量进行了测定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Waters E2695高效液相色谱仪，VARIAN ProStar高效液相色谱仪，离心机（Eppendorf 5810R），KQ-100DE型数控超声波清洗器，Waters Oasis HLB固相萃取小柱（6cc/500mg/60μm），Waters-Sep-Pak-C18固相萃取小柱（6cc/500mg/60μm），Waters Oasis MAX固相萃取小柱（6cc/500mg/60μm），旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；槲皮素、山奈酚标准品（购自上海安谱科学仪器有限公司）；甲醇、乙腈、磷酸、甲酸、乙酸，色谱纯；氨水，分析纯；实验室用水采用去离子水；

1.2 标准溶液的配制（1）标准储备液：分别准确称取一定量标准物质用甲醇定容至浓度均为1 000.0μg/mL；-18℃避光保存，有效期3个月；（2）标准中间液：准确移取槲皮素、山奈酚标准储备液各5mL，用甲醇定容至100mL；-4℃避光保存，有效期1个月。

1.3 样品提取与净化准确称取经烘干磨碎过目筛的三叶青组培苗的根、茎、叶以及愈伤组织块各2.00g于50mL离心管中，加入甲醇提取液35mL，漩涡混匀，超声（功率100W，频率40kHz，温度40℃，时间90min），10 000r离心10min，过滤收集上清液，下层残渣用10mL提取液重复提取1次，合并上清液，待净化。HLB固相萃取小柱预先活化，将全部提取液上样，控制流速约1mL/min；收集液体于鸡心瓶并旋转蒸发至近干，甲醇溶液转移并定容至5mL，过0.22μm微孔滤膜，滤液待上机测定。

1.4 色谱条件色谱柱：Varian ODS C18（4.6mm×250mm×5μm）；柱温：30℃；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；样品室温度：15℃；流动相：A为0.2%磷酸水，B为甲醇；流动相梯度见表1。

表1 色谱分离梯度条件

[时间（min）＼&流动相＼&梯度变化曲线＼&A（%）＼&B（%）＼&0＼&65＼&35＼&6＼&5＼&65＼&35＼&6＼&10＼&52＼&48＼&6＼&28＼&52＼&48＼&6＼&30＼&65＼&35＼&6＼&35＼&65＼&35＼&1＼&]

2 结果与分析

2.1 波长的选择有文献报道，黄酮类化合物因苯甲酰基和桂皮酰基的存在，主要有2个吸收峰，波长范围分别为220～280nm和300～400nm[5-6]。采用二极管阵列检测器对标准使用液经过适当稀释后在200～400nm进行全波长扫描，结果发现，在360nm基线平稳，色谱特征性强、峰型较好，且峰的分离度较高。故本实验选择360nm作为检测波长。

2.2 色谱条件的优化分别选择甲醇、乙腈、磷酸、甲酸、乙酸溶液配合作为流动相进行试验，本文比较了甲醇、乙腈、甲醇+水、乙腈+水、0.1%甲酸水+乙腈、0.1%甲酸水+甲醇、0.1%乙酸水+甲醇、0.1%磷酸水+甲醇、0.2%磷酸水+甲醇、0.3%磷酸水+甲醇、0.5%磷酸水+甲醇作为流动相时的色谱图。结果发现，流动相采用甲醇、乙腈、甲醇+水、乙腈+水时、0.1%甲酸水+乙腈，未出峰；而采用0.1%甲酸水+甲醇、0.1%乙酸水+甲醇、0.1%磷酸水+甲醇时，峰形差、保留时间长且达不到完全分离的目的；而使用0.2%磷酸水+甲醇、0.3%磷酸水+甲醇、0.5%磷酸水+甲醇，色谱图基线稳定，响应值较高、峰的分离度与峰形均较好且无干扰峰；这可能是因为磷酸为无机酸，与乙酸和甲酸相比，能更好的改善峰形和分离度，而0.2%～0.5%磷酸水溶液的pH值为2～3，更有利于减少黄酮类目标物因在色谱柱中吸附而导致的峰难分离与拖尾现象；但是采用磷酸水溶液作为流动性，仪器的系统压力会高些，因此在保证出峰和分离度的情况下，低浓度的磷酸水溶液是首选。从实际结果和经济角度考虑，本文采用0.2%磷酸水+甲醇作为流动相。

2.3 样品前处理方法的选择

2.3.1 提取液和提取方式的选择目前提取三叶青中槲皮素、山奈酚等黄酮类化合物的方法主要是加热回流和超声提取[7-10]，本次实验结果表明，空白样品通过超声提取，槲皮素和山奈酚均有检出，而采用加热回流方式提取的平行样品在同样检出条件下却无检出，说明针对三叶青中槲皮素和山奈酚的提取，超声提取方式优于加热回流方式。故本实验选择超声提取作为提取方式。浦锦宝[11]等研究表明，指出在提取液中加入2%盐酸，对提取槲皮素和山奈酚效果佳。鉴于在强酸条件下三叶青中芦丁易水解生成槲皮素[12]，从而影响三叶青中槲皮素定量的准确性，本文选择了70%甲醇水、90%甲醇水、甲醇作为提取液。结果表明，采用70%甲醇水提取加标样品，2种目标物均未检出；90%甲醇水提取加标样品，槲皮素和山奈酚均未检测，只有甲醇提取，2种目标物均检出，且加标回收率大于90%。因此，本实验选择甲醇作为提取液。

2.3.2 固相萃取小柱的选择黄酮类化合物因分子中有酚羟基而显酸性，而槲皮素和山奈酚均为极性分子；同时，三叶青提取物中除两种目标物外，还含有脂类、色素等弱极性的物质，这些物质的存在不仅会影响目标的分离与检测，还容易富集在色谱柱上残留影响柱效；而采用传统的正己烷、石油醚、乙酸乙酯非极性或弱极性的有机溶剂去除，不仅操作麻烦，而且还会造成目标物的损失，影响分析结果[13]。本文分别考察了C18、HLB、MAX固相萃取小柱对样品的净化效果。Waters Oasis HLB和Waters-Sep-Pak-C18固相萃取小柱预先用10mL甲醇活化，样品提取液通过HLB和C18小柱后，弱极性的脂类和色素等将会保留在小柱上，收集过柱后的液体，这样目标物随着上样而被收集。另外，Waters Oasis MAX用10mL甲醇、10mL水活化，上样后目标物保留在小柱上，弱极性的脂类和色素等在小柱上不保留，依次用5%氨水淋洗，5mL2%甲酸甲醇洗脱。实验结果表明，经MAX净化后的样品加标回收率较低，而经HLB和C18小柱净化过的回收率高且平行性好。因此，HLB和C18小柱均能够作为三叶青提取液净化过程的选择对象，鉴于C18小柱价格高，故本文采样HLB（6cc/500mg/60μm）作为固相萃取柱。

2.4 线性范围、相关系数、方法定量限及精密度的确定将槲皮素和山奈酚的浓度分别为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0μg/mL的混合标准系列，依次进样，以标准溶液浓度X为横坐标，槲皮素和山奈酚的峰面积Y为纵坐标，在适当的线性范围下绘制标准曲线，其中线性范围、相关系数和回归方程见表2所示。

表2 槲皮素和山奈酚的线性范围、回归方程和相关系数

[名称＼&线性范围（μg/mL）＼&回归方程＼&相关系数（r）＼&槲皮素＼&0.05～50.0＼&Y=30400X+496＼&0.9999＼&山奈酚＼&0.05～50.0＼&Y=39700X+572＼&0.9999＼&]

以槲皮素和山奈酚5.0μg/mL的混合标准溶液重复进样7次，验证仪器的精密度，发现7次进样的相对标准偏差为0.3%～1.4%。以2～5倍基线噪音响应对应的浓度进行空白加标，以3倍信噪比（S/N）估算方法定量限，2种目标化合物的方法检出限均为0.05mg/kg。混合标准液和三叶青样品溶液色谱图如图1所示。

[0.008

0.006

0.004

0.002

0.000][AU][0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00][时间（min）][色谱图][A][1][2]

[0.22

0.20

0.18

0.16

0.14

0.12

0.10

0.08

0.06

0.04

0.02

0.00][AU][0.00][2.00][4.00][8.00][6.00][10.00][12.00][14.00][16.00][20.00][18.00][22.00][26.00][24.00][28.00][30.00][32.00][34.00][时间（min）][1][2][B]

A.2种目标物；B.三叶青样品；1.槲皮素；2.山奈酚

图1 HPLC色谱

2.5 三叶青不同部位含量测定及加标回收试验结果为准确确定三叶青样品中目标物的含量并考察了三叶青各组培物基质对实验结果产生的影响，本实验选取了三叶青组培苗的根、茎、叶以及愈伤组织块作为空白样，结果列于表3。由表3可知，对不对三叶青各组培物含量的测定及加标回收率试验，三叶青各组培物中目标物的含量顺序是：根>茎>叶>愈伤组织块，且槲皮素和山奈酚的平均加标回收率范围为71.9%～105.8%，相对标准偏差为1.5%～3.4%，表明该方法重复性好且定量准确。

表3 样品分析及加标回收试验结果（n=3）

[样品＼&指标＼&根＼&茎＼&叶＼&愈伤组织块＼&槲皮素＼&含量（mg/kg）＼&4.66＼&1.03＼&2.23＼&＼&加标量（mg/kg）＼&1.0＼&1.0＼&1.0＼&1.0＼&平均加标回收率（%）＼&83.3＼&91.8＼&79.2＼&103.4＼&RSD（%）＼&2.1＼&1.5＼&3.4＼&＼&山奈酚＼&含量（mg/kg）＼&5.47＼&0.59＼&0.09＼&＼&加标量（mg/kg）＼&1.0＼&1.0＼&1.0＼&1.0＼&平均加标回收率（%）＼&92.3＼&87.5＼&71.9＼&105.8＼&RSD（%）＼&3.3＼&2.9＼&2.5＼&＼&]

3 结论

本次研究通过对液相条件、前处理条件的优化，建立了以甲醇作为提取液、HLB（6cc/500mg/60μm）作为固相萃取柱、0.2%磷酸水-甲醇作为流动相，在波长360nm条件下，同时测定三叶青组培物中槲皮素和山奈酚的高效液相色谱分析法。该方法不仅是首次应用于三叶青组培物中槲皮素和山奈酚的含量测定，而且采用的固相萃取小柱净化样品，克服了传统有机溶剂脱脂、去除色素等杂质对目标物含量造成损失的缺点。通过对三叶青组培物中目标物含量的测定，目标物含量的顺序是：根>茎>叶>愈伤组织块，且槲皮素和山奈酚的平均加标回收率范围为71.9%～105.8%，相对标准偏差为1.5%～3.4%，而且检出限低、重复性好且定量准确。

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