响应面法优化猪血红蛋白抗菌肽的制备工艺

潘晓倩 成晓瑜 张顺亮等

摘 要：以猪血红蛋白为原料，利用筛选出的蛋白酶水解制备抗菌肽，以酶解液抑菌率和水解度为指标，通过单因素试验对酶解温度、加酶量和酶解时间3个主要工艺参数进行研究，在此基础上，通过响应面优化酶解工艺，建立数学模型。结果表明，胰蛋白酶最适合水解猪血红蛋白制备抗菌肽，其最佳条件为酶解温度49.72℃、加酶量2852.81U/g、酶解时间5.19h，酶解产物抑菌率的理论预测值89.70%，实际测量值90.32%。可见，利用胰蛋白酶水解猪血红蛋白能够得到抑菌活性较高的酶解产物，且该模型能够较好的预测抗菌肽制备最佳工艺条件。

关键词：猪血红蛋白；抗菌肽；酶解；响应面

中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）11-0001-05

抗菌肽（antibacterial peptide，ABP）是生物体天然免疫防御系统的重要组成部分，多数是一类分子质量小于10kD，带有正电荷，在链长、序列及结构方面具有多样性的两亲性肽类[1-2]。抗菌肽具有抗菌谱广、热稳定性高、安全高效等诸多优点，食物源蛋白抗菌肽的制备成为生物领域的研究热点之一[3-4]。目前抗菌肽的制备方法有：从动植物组织中直接提取法、化学合成法、基因工程法和酶解法。因酶解法具有反应条件温和、过程容易控制等诸多优点，被认为是大批量制备抗菌肽最有前途的方法[5-6]。因酶在剪切肽键时具有一定特异性，当选取的酶解底物不同时，也应选取不同种类的酶进行水解以获得抗菌性。如Pellegrini等[7]用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶酶解牛乳α-乳清蛋白均可以得到抗菌组分，而用胃蛋白酶水解得到的多肽组分则无抗菌性。吴林泽等[8]发现用碱性蛋白酶酶解罗非鱼下脚料所得粗肽组分对金黄色葡萄球菌具有很好的抗菌性。

目前，我国生猪屠宰加工产业迅速发展，2012年，我国生猪出栏69628万头，增长5.2%，猪肉产量达到5335万吨，增长了5.6%[9]。猪血是生猪屠宰加工过程中的主要副产物之一，营养价值很高，素有“液态肉”之称[10]，我国猪血资源非常丰富，但利用率低，不超过10%，如被加工成血粉作为饲料添加剂，用于生化制药中血红素、蛋白胨的生产，这些产品附加值低，而大多数作为废弃物直接排出，造成了资源浪费和环境污染[11]。欧美、日本等发达国家将猪血开发成肽类试剂、肽类药物等多种功能食品及食品添加剂，普遍推广，利用率达50%以上[12]。因此，以猪血为底物开发生物活性肽，可以提高生猪屠宰加工企业产品附加值，显示出巨大的市场前景[13]。

本实验以猪血红蛋白抗菌肽复合物为研究对象，选取最佳酶类进行水解，并以金黄色葡萄球菌为指示菌，采用单因素试验和响应面法优化抗菌肽制备的酶解工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜猪血采自北京资源集团；金黄色葡萄球菌 中国肉类食品综合研究中心检测中心实验室。

NaOH、盐酸、乙醇、NaCl（分析纯） 北京化学试剂厂；甲醛溶液（分析纯，质量分数37.0%～40.0%） 西陇化工股份有限公司；中性蛋白酶（枯草芽孢杆菌）、碱性蛋白酶（枯草杆菌）、复合蛋白酶、风味蛋白酶（米曲霉） 诺维信（中国）投资有限公司；胰蛋白酶（胰脏）、木瓜蛋白酶（木瓜）、胃蛋白酶（猪胃） 国药集团化学试剂有限公司；平板计数琼脂、营养肉汤 北京陆桥技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

SCIENTZ-IID型超声波细胞破碎机 北京久润天诚科技发展有限公司；KDY-9820凯氏定氮仪 北京市通润源机电技术有限责任公司；PB-10型数显酸度计 赛多利斯科学仪器有限公司；GL-20G-II型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；SL502N型电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；202A-0恒温干燥箱 上海和盛有限公司；生物安全柜 新加坡Esco公司；F1-45型恒温培养箱、G154DWS湿热灭菌锅 日本三洋公司；CLW-002中空纤维超滤组件 北京旭邦膜设备有限责任公司；LM-125中空纤维超滤试验装置 北京旭成超滤设备厂；LGJ-30D冷冻干燥机 北京四环科学仪器厂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶活力测定

采用Folin-酚法[14]。

1.3.2 猪血红蛋白的制备[15]

屠宰过程中采集新鲜猪血，并迅速加入质量浓度为5g/L的柠檬酸钠抗凝，4℃保存。将新鲜猪血在4℃、8000r/min离心10min，收集下层沉淀，以获得红血球及血浆；并加入同等体积的蒸馏水，超声波细胞破碎辅助溶血20min，然后在4℃、4000r/min离心10min，得到血红蛋白溶液，于4℃保存备用。

1.3.3 猪血红蛋白酶解物的制备

取适量血红蛋白溶液，在不同水解酶适宜条件下加入酶制剂进行酶解，酶解过程中不断搅拌，并且通过滴加1mol/L NaOH溶液或HCl溶液维持体系pH值，不同蛋白酶酶解适宜条件见表1。酶解结束后，沸水浴10min，冷却，调节pH值至7.0左右，8000r/min离心15min，获得上清酶解液4℃冷藏备用。

1.3.4 猪血红蛋白酶解物分离及脱色[16]

采用中空纤维超滤设备，选取截留分子质量为10kD的纤维柱对猪血红蛋白酶解产物进行分离及脱色，以除去大分子蛋白类物质，然后将分离物冷冻干燥、―20℃保存备用。

1.3.5 水解度的测定

水解度是衡量蛋白质水解程度的重要指标之一，水解度越大，表明蛋白质水解越彻底，游离氨基酸的含量越高。总氮测定采用微量凯氏定氮法[17]；游离氨基氮测定采用甲醛滴定法[18]。

1.3.6 抗菌肽抑菌率的测定

采用活菌计数法[19]，略作修改。将金黄色葡萄球菌纯培养至对数生长期并用无菌生理盐水进行梯度稀释，调整细菌最终菌落数为2.0×103CFU/mL，吸取细菌培养物200μL至无菌Eppendorf管中，共2管，1管为实验管，1管为对照管。实验管中加入800μL经0.45μm滤膜过滤的质量浓度为25mg/mL的猪血红蛋白抗菌肽，终体积为1mL；对照管中加入800μL无菌生理盐水。将各管中液体混匀后，于37℃条件振荡孵育60min后取200μL涂布于平板计数琼脂上，37℃培养24h后，观察并纪录每个营养琼脂平板上的菌落数量。根据稀释度和接种量计算出每管原液中的细菌数量，按下述公式计算抑菌率：

1.3.7 单因素优化试验

以酶解液的水解度和对金黄色葡萄球菌的抑菌率为指标，分别研究酶解时间、温度、加酶量3个主要工艺参数对酶解效果的影响。

1.3.8 酶解条件的响应面优化试验

根据单因素试验的结果，以对金黄色葡萄球菌的抑菌率为响应值，通过Design-Expert 8.0软件采用3因素3水平的Box-Behnken试验设计原理设计响应面试验，考察酶解时间、加酶量和酶解温度这3个单因素及交互作用对酶解效果的影响。

1.3.9 数据处理

实验数据均是经过3次平行试验得到的平均值，Excel 2007 统计分析所有数据，计算标准误并制图，使用Design Expert 8.0分析响应面数据。

2 结果与分析

2.1 最佳水解酶的选择

不同水解酶酶解猪血红蛋白得到的酶解液抑菌效果差异很大，其中碱性蛋白酶和胰蛋白酶的效果较好，抑菌率分别达到82.62%和88.42%，而风味蛋白酶、复合蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶酶解产物则没有任何抑菌效果，甚至还会促进菌的生长，其原因可能与酶解底物特异性及酶的作用肽键具有特异性有关，当选取的酶解底物不同时，也应选取不同种类的酶进行水解以获得抗菌性。同时，由表2还可看出，在用不同水解酶作用时，其抑菌效果的好坏与水解度的高低没有直接关系，考虑本实验以抗菌肽的制备为目的，因此选择胰蛋白酶进行后续实验。

2.2 胰蛋白酶水解的单因素试验结果

2.2.1 酶解温度对酶解液抑菌率和水解度的影响

在加酶量3000U/g，pH值调至8.0的条件下，分别在30、35、40、45、50、55℃的温度下酶解5h，考察不同酶解温度对酶解效果的作用。由图2可知，当酶解温度在30～50℃范围内升高时，酶解液抑菌率和水解度均呈现上升趋势，而当酶解温度升至55℃时，抑菌率和水解度均开始下降。在一定温度范围内的升温有助于酶活性的增加，从而提高酶解效率，但超出这个范围就会降低酶的活性。同时，血红蛋白水解程度越大，水解产物的抑菌效果就越好，二者变化趋势相近，这与胡志和等[20]在水解酪蛋白制备抗菌肽时所得的结论相同。

2.2.2 加酶量对酶解液抑菌率和水解度的影响

在酶解温度50℃，pH值调至8.0的条件下，分别在加酶量为1000、1500、2000、2500、3000、3500U/g的条件下酶解5h，考察不同加酶量对酶解效果的作用。由图3可知，当加酶量在1000～3000U/g的范围内增加时，抑菌率和水解度都快速增加，当达到3500U/g时，两者均有所下降。原因可能是当底物过量时，加酶量的增加能促进水解，进而产生更多的活性肽，抑菌率增加，但加酶量继续增加导致酶过量，可能会导致活性肽过度水解成为无活性小片段或者造成酶的自身水解，降低酶活性。

2.2.3 酶解时间对酶解液抑菌率和水解度的影响

在加酶量3000U/g、酶解温度50℃、pH值调至8.0的条件下，分别酶解1、2、3、4、5、6h，考察不同酶解时间对酶解效果的作用。由图4可知，酶解产物的抑菌率随着酶解时间的延长而增加，到5h时，抑菌率和水解度均达到最大，到6h时，有所下降，可能由于过长时间水解造成酶自身分解，水解度降低后导致水解产物抑菌率的降低。

2.3 酶解条件响应面优化结果

2.3.1 响应面试验结果与方差分析

回归系数显著性检验显示：一次项A、B的P值均小于0.05，达到显著水平；一次项C的P值小于0.01，达到极显著水平，说明酶解温度、加酶量和酶解时间3个因素均对酶解液的抑菌效果具有显著影响。A2、B2、C2项P值均小于0.01，说明这3个因素对响应值具有极显著的二次效应，它们与抑菌率之间的关系符合曲线规律。交互项AB项P值小于0.01，表明温度与加酶量交互作用极显著；AC项P值小于0.05，表明温度与酶解时间的交互作用显著。由P值可知，在试验范围内影响酶解液抑菌效果的因素依次为：酶解温度<加酶量<酶解时间。

2.3.2 响应面分析

2.4 验证实验

通过Design Expert8.0软件分析，血红蛋白通过胰蛋白酶酶解所得酶解液抑菌效果最好的工艺条件为：酶解温度49.72℃、加酶量2852.81U/g、酶解时间5.19h，此时所得酶解液的抑菌率为89.70%。为了检验该方法所得结果的可靠程度，在上述最佳反应条件下进行猪血红蛋白酶解反应，所得酶解液经脱色冷冻干燥后检测其抑菌效果，得到的抑菌率实际值平均为90.32%，相对误差为0.691%，可见该模型能较好地预测猪血红蛋白抗菌肽的实际制备情况。

3 结 论

利用7种酶水解猪血红蛋白发现，胰蛋白酶酶为制备抗菌肽的最佳用酶。通过单因素试验确定了抗菌肽制备过程中酶解温度、加酶量和酶解时间的最适范围。在单因素的基础上，利用Box-Behnken模型响应面设计方法进一步优化胰蛋白酶酶解猪血红蛋白制备抗菌肽的工艺条件。通过Design Expert8.0软件分析得其最优条件为：酶解温度49.72℃、加酶量2852.81U/g、酶解时间5.19h，对响应面的结果进行验证，酶解产物的抑菌率平均值为90.32%。本实验以对金黄色葡萄球菌的抑菌率为指标，探讨了响应面法优化胰蛋白酶水解猪血红蛋白制备抗菌肽的工艺条件，为酶解液中抗菌肽的分离纯化及结构鉴定提供了实验依据。同时，可进一步选取其他常见的指示菌表征酶解产物的抑菌效率。

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