陈皮对烘烤牛肉干中杂环胺含量的影响

夏新武 王武 陈从贵等

摘 要：探讨陈皮对烘烤牛肉干中杂环胺生成及牛肉干质量损失率、色差、感官指标的影响。陈皮的总酚物质含量及抗氧化能力分别通过福林-酚法及DPPH法测定，牛肉干中杂环胺含量利用高压液相色谱法测定。在没有经过陈皮水提物腌制处理牛肉干中检测出2-氨基-3，8-二甲基咪唑并[4，5-F]喹喔啉（MeIQx）、2-氨基-3，4，8-三甲基咪唑并[4，5-F]喹喔啉（4，8DiMeIQx）、9H-吡啶并[3，4-B]吲哚（Norharman）、1-甲基-9H-吡啶并[3，4-B]吲哚（Harman）和2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑并[4，5-B]吡啶（PhIP），总含量为44.01ng/g。160mg/mL的陈皮水提物可显著降低MeIQx（34.3%），PhIP（96.5%），但是显著增加了Norharman（32.4%）；且陈皮提取液浓度越高、腌制时间越长，其对牛肉干中杂环胺含量的影响越大；陈皮腌制处理对牛肉干质量损失率没有显著影响，而色泽随着陈皮浓度的升高而明显变淡；感官评价表明经过陈皮腌制的牛肉干在颜色及风味感官品质上无不良影响。因此，陈皮提取物腌制是一种较好的抑制烘烤牛肉干中杂环胺的方法。

关键词：陈皮；总酚含量；抗氧化能力；杂环胺；牛肉干

牛肉和鱼肉中发现杂环胺[1]，此后，烹饪过程中有害物质的形成及其对人体健康影响方面的研究得到了广泛关注。饮食过程中杂环胺的摄入会增加包括直肠、胃、肺、胰腺、乳腺和前列腺部位癌变的风险[2-3]。国际癌症研究中心将2-氨基-3，8-二甲基咪唑并[4，5-F]喹喔啉（MeIQx）和2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑并[4，5-B]吡啶（PhIP）等杂环胺列为可能致癌物，将2-氨基-3-甲基咪唑并[4，5-F]喹啉（IQ）列为可能性很大的致癌物[4]。迄今为止，已经有超过30种杂环胺被从不同的烹饪肉制品中分离鉴定出来。

根据生成途径的不同，杂环胺可分为氨基咪唑氮与氨基咔啉两类，前者主要是氨基酸、葡萄糖、肌酸和肌酸酐在热条件下通过美拉德反应形成；后者中除了9H-吡啶并[3，4-B]吲哚（Norharman）和1-甲基-9H-吡啶并[3，4-B]吲哚（Harman）外都在300℃条件下由氨基酸或蛋白质热裂解形成[5-6]。美拉德反应过程中的自由基反应参与了杂环胺的生成，人工合成及天然抗氧化成分物质被证明可以抑制杂环胺的生成。电子自旋共振光谱证明了抗氧化物质对杂环胺生成过程中吡嗪阳离子自由基的清除作用[7]。

研究表明，富含抗氧化物质的天然植物提取物对抑制加工肉制品中杂环胺的生成有明显效果。Gibis等[8]研究了葡萄籽和迷迭香提取物腌制对煎牛肉饼中杂环胺的抑制效果，结果表明，经过提取物的腌制过程，MeIQx和PhIP 的抑制率可分别达到57%和90%。Quelhas等[9]研究了绿茶腌渍液对平底锅煎烤牛肉中2-氨基-9H-吡啶并[2，3-B]吲哚（AαC）、2-氨基-3，4，8-三甲基咪唑并[4，5-F]喹喔啉（4，8DiMeIQx）、MeIQx、PhIP四种杂环胺的生成影响，结果表明，PhIP和AαC的浓度明显下降（P<0.05）；4，8DiMeIQx，MeIQx的浓度无明显变化，并且在处理样品中无不良感官评价。

陈皮富含抗氧化类多酚物质，现代技术已经检测到其中含有橙皮苷、柚皮苷、川陈皮素、橘皮素、功能性多糖等物质[10-11]，且有研究表明其具有抗脂质氧化与清除自由基作用[12-13]。陈皮也因其特有的芳香性风味性质，被应用到多种食品加工过程中。对于陈皮水提物对烘烤牛肉干中杂环胺种类和含量的影响未见报道。本实验考查陈皮水提液腌渍处理对烘烤牛肉干中6种不同杂环胺含量的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

恒都牛后腿肉、新会陈皮 市购。

杂环胺标品：2-氨基-3-甲基咪唑并[4，5-F]喹啉（IQ）、2-氨基-3，8-二甲基咪唑并[4，5-F]喹喔啉（MeIQx）、2-氨基-3，4，8-三甲基咪唑并[4，5-F] 喹喔啉（4，8DiMeIQx）、9H-吡啶并[3，4-B]吲哚（Norharman）、1-甲基-9H-吡啶并[3，4-B]吲哚（Harman）、2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑并[4，5-B]吡啶（PhIP） 加拿大Toronto Research Chemicals公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼 （DPPH） 美国Sigma-Aldrich公司。

没食子酸标准品为色谱纯；甲醇、乙腈为色谱级；醋酸胺、冰醋酸、二氯甲烷、氨水等皆为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Extrelut NT20空柱 美国Varian公司；硅藻土、Bond Elut-PRS柱（500mg/3mL）、Bond Elut-C18柱（500mg/3mL，100mg/1mL）、Agilent1100 高相液相色谱仪、G1315A紫外检测器、G1312A荧光检测器 美国安捷伦公司；TSK gel ODS-80TM 色谱柱（250×4.6mm，5μm，80A） 日本Tokyo公司；DC-12固相萃取装置 天津东康科技有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；T-J-200高速分散均质机 上海标本模型厂；CT14 RD台式高速冷冻离心机 上海天美生化仪器设备工程有限公司；WB-2000IXA全自动测色色差仪 北京康光仪器有限公司；电子天平 美国Satorius公司；752N紫外可见分光光度计 上海精科仪器有限公司；远红外高级食品烤箱 瑞安市成业食品机械厂；LG-04高速中药粉碎机 瑞安市百信药机器械厂。

1.3 方法

1.3.1 陈皮腌渍液制备

陈皮原料经过粉碎后过60目筛，分别取4、7、10、13、16g 陈皮粉末置于250mL锥形瓶中，加入100mL体积分数为10%的乙醇水溶液，在80℃水浴条件下提取30min后超声提取5min，再放入80℃水浴条件下提取30min。制备好的腌制液保存待用。另将制备好的质量浓度为40mg/mL陈皮腌制液在4000r/min条件下离心5min，取其上清液用于陈皮总酚含量及抗氧化能力的测定。

1.3.2 陈皮总酚含量测定

陈皮总酚含量测定采用福林-酚法[14]且以没食子酸当量表示，以每克陈皮中的没食子酸当量（galic acid equivalent，GAE）的毫克数计（mg GAE/g）。取1mL适度稀释后的陈皮水提物于10mL试管中，加入福林-酚试剂2.5mL并摇匀反应5min，之后再加入2mL饱和Na2CO3溶液并用蒸馏水定容至10mL，在室温条件下（25℃）反应2h后于760nm波长处测定吸光度。以蒸馏水做对照，以没食子酸溶液为标准，绘制标准曲线，结果以没食子酸当量表示。每个样品平行测定3次，取平均值。

1.3.3 陈皮抗氧化能力测定

陈皮抗氧化能力通过1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2，2-diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl） hydrazyl，DPPH）自由基清除能力表示，参照Singh等[15]的方法作轻微改进，将40mg/mL陈皮水提物分别逐次稀释到8、1.6、0.32、0.064、0.0128、2.56×10-3、5.12×10-4、1.02×10-4mg/mL。分别取各质量浓度的水提物1.5mL、蒸馏水0.5mL、2×10-4mol/L DPPH溶液2mL混于10mL试管中，混匀后在避光下反应30min。以同样条件下添加2mL蒸馏水的为对照组，在517nm下测定吸光度，以L-抗坏血酸（VC）作为阳性对照。每个样品平行测定3次，取平均值，按以下公式计算DPPH自由基清除率：

DPPH+清除率/%=[（A1-A2）/A1]×100

式中：A1为对照组吸光度；A2为样品吸光度。

1.3.4 质量损失率和色差测定

陈皮腌制牛肉干的质量损失率分别由牛肉干烘烤测的质量所得。在牛肉干烤制之前后分别测定牛肉干的质量以及色度（L值、a值、b值），烤制前注意牛肉干上腌制液的沥干，平行3次实验，取平均值。

1.3.5 感官品质测定

对陈皮腌制处理烘烤牛肉干的感官指标进行测定，选择10名专业的食品专业评分员对样品进行颜色和风味的评价。考察颜色和风味2个指标，各指标采用5分制。1～2分代表颜色较浅；3分代表颜色一般；4～5分代表颜色较深。对于风味：1～2分代表无明显陈皮风味，3分代表有轻微陈皮风味，4～5分代表有明显陈皮风味。最后以2个指标之和作为总分。

1.3.6 杂环胺含量测定

采用高效液相色谱法测定样品中的杂环胺，参照Gross 等[16]和万可慧等[17]的方法并作轻微改进，样品经均质机均质后需经过高速冷冻离心机在10000r/min条件离心20min后取上层液体再与硅藻土混合，转入NT20空柱中并淋洗至PRS柱以及C18柱后收集。

1.4 前处理

1.4.1 陈皮提取液质量浓度对牛肉干质量损失率和色差的影响

选取4cm×2cm×0.5cm质量约19g的肉干分别于40、70、100、130、160mg/mL的陈皮提取液中腌制4h，并且在烤制前后10min测定牛肉干的质量与色度。

1.4.2 陈皮提取液质量浓度对牛肉干感官品质的影响

选取4cm×2cm×0.5cm质量约19g的肉干分别于40、 70、100、130、160mg/mL的陈皮提取液中腌制4h，在烤制后测定其感官品质。

1.4.3 陈皮提取液质量浓度对杂环胺含量的影响

将牛肉切成4cm×2cm×0.5cm质量约19g的肉干，分别将牛肉干置于配好备用的40、70、100、130、160mg/mL的陈皮提取液中腌制4h，同时以只加100mL蒸馏水的样品作为对照。腌制结束后将牛肉干放在锡箔纸上于远红外食品烤箱中在200℃烘烤10min。烘烤结束完成指标检测后将牛肉干袋装密封于-20℃下保藏，平行3次取平均值。

1.4.4 陈皮腌制时间对杂环胺含量的影响

取4cm×2cm×0.5cm质量约19g的肉干分别置于100mg/mL陈皮腌制液中浸泡1、2、4、8、16h，以不在100mg/mL陈皮腌制液中腌制的牛肉干为对照。同样结束后将牛肉干放在锡箔纸上于远红外食品烤箱中在200℃下烘烤10min。烘烤结束完成指标检测后将牛肉干袋装密封于―20℃条件下保藏，平行3次，取平均值。

1.5 数据处理

所得数据用SPSS 19.0统计软件进行平均值、方差、差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 陈皮提取物的总酚含量及抗氧化能力

2.2 陈皮提取液对牛肉干质量损失率和色差的影响

时差异最显著。烘烤肉制品颜色通常也是作为一个衡量肉制品烘烤程度的指标，但5组处理组牛肉干质量损失率无显著性差异表明其烘烤程度也没有显著性差异，其原因可能是陈皮腌渍液本身携带的颜色作用在牛肉干上引起的现象。

加工肉制品中杂环胺的含量受到加工条件、肉体种类、肉体部位等因素的多重影响，例如加工温度、加工时间与肉制品中杂环胺的含量有重要联系。图2中质量损失率的变化显示不同浓度陈皮腌制液处理下的牛肉干的烘烤程度无显著差异，可认为牛肉干中杂环胺含量没有受烘烤程度的影响。

2.3 陈皮提取液对牛肉干感官品质的影响

2.4 陈皮提取液质量浓度对杂环胺含量的影响

在对照组中检测到了5种杂环胺且总含量达到了44.01ng/g。其检测结果与万可慧等 [17]对市售牛肉干中杂环胺的含量的结果有比较性。在40mg/mL陈皮提取液处理组样品中检测到PhIP含量与对照组有显著差异（P<0.05），其含量由对照组中（8.08±0.35）ng/g下降到（1.66±0.45）ng/g，抑制率达到79.5%。其余4种杂环胺含量并未发现显著变化。随着陈皮提取液浓度的提高，MeIQx与Norharman的含量在质量浓度为130mg/mL时出现显著变化（P<0.05），其中Norharman的含量呈增加趋势，并在质量浓度为160mg/mL时变化更为显著；MeIQx含量由（8.16±0.55）ng/g下降到（5.36±0.10）ng/g，抑制率达到了34.3%；PhIP的抑制率达到了96.5%。

Britt等[18]研究了在烤牛肉饼中添加樱桃组织抑制杂环胺的效果，结果显示，PhIP的含量分别被蒙莫朗西（Montmoreny）和巴拉顿（Balaton）两种不同的樱桃组织分别抑制了93%和87%。Gibis[19]研究了含有大蒜、洋葱和柠檬汁的腌渍液对煎烤牛肉饼中杂环胺生成的影响，结果表明，当大蒜的添加量为20g/100g时，牛肉饼中MeIQx的质量分数降低70%。姚瑶等[20]在研究中发现香辛料在抑制杂环胺形成的同时也会促进另外几种杂环胺的产生。与前人研究结果不同的是，实验中Norharman的含量明显增加32.4%。Yaylayan[21]等研究了Norharman的生成机制，发现色氨酸的重排产物首先以呋喃糖的形式进行脱水反应，随后在环氧孤对电子的辅助下进行β-消去反应请核实从而形成一个共轭的氧鎓离子。这个反应中间体可以通过脱水形成一个扩展的共轭体系从而进一步稳定自身，或者通过C—C键分裂而产生一个中性的呋喃衍生物和一个亚胺鎓阳离子，随后中间体进行分子内亲核取代反应形成β-咔啉。

由表1可知，陈皮提取液质量浓度为100mg/mL时，MeIQx与Norharman的含量均未被发现有显著性变化（P>0.05），但在质量浓度为130mg/mL时发现有显著性变化（P<0.05）。因此考查在陈皮提取液质量浓度为100mg/mL时，腌制时间的长短对牛肉干中杂环胺含量的影响。

2.5 陈皮提取液腌制时间对杂环胺含量的影响

在腌制时间为1h时，PhIP含量就有了显著性的下降，而在1～4h内其余4种杂环胺都未发现显著性变化。当腌制时间为8h时，MeIQx的含量发生显著性变化，而Norharman的含量在腌制时间为16h时才出现显著性变化。值得注意的是，在腌制时间为16h，提取液质量浓度为100mg/mL时，PhIP的含量达到了99%的抑制。Quelhas等[22]考查了绿茶腌制时间与绿茶对杂环胺效果之间的相关性分析，结果发现二者之间有显著相关性。实验中同时考查了陈皮提取液浓度和陈皮腌制时间对牛肉干中杂环胺含量的影响，结果表明二者都能够促进陈皮提取液的影响效果。

3 结 论

陈皮提取物具有良好的抗氧化能力。在陈皮腌制处理烘烤牛肉干中检测出了MeIQx、4，8DiMeIQx、Norharman、Harman和PhIP共5种杂环胺，并发现其能显著抑制（P<0.05）烘烤牛肉干中MeIQx（34.3%）和PhIP（96.5%）的含量并显著增加了Norharman（32.4%）的含量，但是在总体上抑制了杂环胺的生成。陈皮提取物的浓度越高、腌制的时间越长，杂环胺的变化越明显。经陈皮处理过的牛肉干在质量损失率上没有发生显著变化（P>0.05）；而色泽随着陈皮提取液质量浓度的升高而明显变淡；经过陈皮腌制的牛肉干在颜色及风味感官品质上无不良影响；陈皮提取物除了多酚类抗氧化物质外还有许多其他物质，且由自由基参与的杂环胺形成过程只是一部分，对肉制品中杂环胺的抑制还有待进一步研究；综上所述，陈皮提取物腌制是一种较好的抑制烘烤牛肉干中杂环胺的方法。

参考文献：

[1] NAGAO M， HONDA M， SEINO Y， et al. Mutagenicities of smoke condensates and the charred surface of fish and meat[J]. Cancer Letters， 1977， 2（4）： 221-226.

[2] WARD M H， SINHA R， HEINEMAN E F， et al. Risk of adenocarcinoma of the stomach and esophagus with meat cooking method and doneness preference[J]. International Journal of Cancer， 1997， 71（1）： 14-19.

[3] HIROSE M， NISHIKAWA A， SHIBUTANI M， et al. Chemoprevention of heterocyclic amine‐induced mammary carcinogenesis in rats[J]. Environmental and Molecular Mutagenesis， 2002， 39（23）： 271-278.

[4] IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans[M]. Geneva： World Health Organization， 2007.

[5] J?GERSTAD M， LASER-REUTERSW?RD A， ?STE R， et al. Creatinine and Maillard reaction products as precursors of mutagenic compounds formed in fried beef[J]. The Maillard Reaction in Foods and Nutrition， 1983， 215： 507-519.

[6] J?GERSTAD M， SKOG K， ARVIDSSON P， et al. Chemistry， formation and occurrence of genotoxic heterocyclic amines identified in model systems and cooked foods[J]. Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchungund-Forschung A， 1998， 207（6）： 419-427.

[7] KIKUGAWA K， KATO T， HIRAMOTO K， et al. Participation of the pyrazine cation radical in the formation of mutagens in the reaction of glucose/glycine/creatinine[J]. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis， 1999， 444（1）： 133-144.

[8] GIBIS M， WEISS J. Antioxidant capacity and inhibitory effect of grape seed and rosemary extract in marinades on the formation of heterocyclic amines in fried beef patties[J]. Food Chemistry， 2012， 134（2）： 766-774.

[9] QUELHAS I， PETISCA C， VIEGAS O， et al. Effect of green tea marinades on the formation of heterocyclic aromatic amines and sensory quality of pan-fried beef[J]. Food Chemistry， 2010， 122（1）： 98-104.

[10] 张志海，王彩云，杨天鸣，等.陈皮的化学成分及药理作用研究进展[J].西北药学杂志，2005， 20（1）： 47-47.

[11] 戴航， 侯小涛， 程世贤， 等. 陈皮的有效成分定量方法研究进展[J]. 广西中医学院学报， 2008， 11（1）： 59-61.

[12] 左锦静. 陈皮甘草抗氧化活性成份提取及抗氧化作用研究[D]. 郑州： 河南工业大学， 2005： 41-63.

[13] YI Zhibiao， YU Yan， LIANG Yizeng， et al. In vitro antioxidant and antimicrobial activities of the extract of Pericarpium Citri Reticulatae of a new citrus cultivar and its main flavonoids[J]. LWT-Food Science and Technology， 2008， 41（4）： 597-603.

[14] SINGLETON V L， ROSSI J A. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents[J]. American Journal of Enology and Viticulture， 1965， 16（3）： 144-158.

[15] SINGH R P， CHIDAMBARA MURTHY K N， JAYAPRAKASHA G K. Studies on the antioxidant activity of pomegranate （Punica granatum） peel and seed extracts using in vitro models[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2002， 50（1）： 81-86.

[16] GROSS G A， GR?TER A. Quantitation of mutagegnic/carcinogenic heterocyclic aromatic amines in food products[J]. Journal of Chromatography A， 1992， 592（1）： 271-278.

[17] 万可慧，彭增起，邵斌，等.高效液相色谱法测定牛肉干制品中10种杂环胺[J].色谱，2012， 30（3）： 285-291.

[18] BRITT C， GOMAA E A， GRAY J I， et al. Influence of cherry tissue on lipid oxidation and heterocyclic aromatic amine formation in ground beef patties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1998， 46（12）： 4891-4897.

[19] GIBIS M. Effect of oil marinades with garlic， onion， and lemon juice on the formation of heterocyclic aromatic amines in fried beef patties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2007， 55（25）： 10240-10247.

[20] 姚瑶， 彭增起， 邵斌， 等. 20种市售常见香辛料的抗氧化性对酱牛肉中杂环胺含量的影响[J]. 中国农业科学， 2012（20）： 136-143.

[21] YAYLAYAN V， PAR? J R， LAING R， et al. Formation of β-carbolines from 1-[（1-carboxy-2-indol-3-yl-ethyl） amino]-1-deoxy-D-fructose under electron impact conditions[J]. Organic Mass Spectrometry， 1990， 25（3）： 141-145.

[22] QUELHAS I， PETISCA C， VIEGAS O， et al. Effect of green tea marinades on the formation of heterocyclic aromatic amines and sensory quality of pan-fried beef[J]. Food Chemistry， 2010， 122（1）： 98-104.