破血化瘀填精补髓法对脑出血大鼠脑组织含水量的影响

赵德喜，熊 壮，王 健

(长春中医药大学附属医院，长春 130021)

脑水肿是ICH后继发性损伤的关键因素之一。本实验观察大鼠ICH模型经脑出血方干预后脑水含量变化，并采用免疫组化技术观察各组MMP-2/MMP-9表达的情况。探讨ICH后脑水肿的发生机制及脑出血方的作用机理，进一步阐释出血性脑卒中“髓虚毒损”病机核心的科学内涵，为破血化瘀填精补髓法治疗ICH提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 健康Wistar大鼠128只(由吉林大学药学院提供),雌雄各半，鼠龄3～4个月，体质量250～330 g。随机选择8只做正常对照组，24只为假手术组，其余大鼠制备ICH模型。造模后将大鼠放回笼中饲养,自由活动及饮食。将造模成功大鼠随机分为ICH模型组、脑出血方低、中、高剂量组各24只。

1.2 仪器 脑立体定位仪(美国STOELTING公司)；手持式牙科钻(上海齿科医械厂);微量进样器(上海安亭微量进样器厂)；生物组织包埋机(天津航空机电公司);静脉留置针(小蝶型，24 G)等。

1.3 药品与试剂 脑出血方药物组成：生蒲黄15 g，水蛭8 g，虻虫5 g，生大黄10 g，瓜蒌20 g，三七10 g，龟板胶10 g，石菖蒲15 g(以上药物购自长春中医药大学附属医院)。按传统方法煎煮，在恒温水槽中浓缩成1 mL含原生药0.465 g的汤剂，4 ℃保存备用。

MMP-2、MMP-9一抗均购自武汉博士德生物技术有限公司。SP(Streptavidin/Peroxidase)免疫组化染色试剂盒组成，试剂A：内源性过氧化酶阻断剂；试剂B：10%正常非免疫动物血清；试剂C:生物素标记羊抗兔IgG(第二抗体)；试剂D：链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶，购于福建迈新生物技术有限公司；DAB显色试剂盒购于福建迈新生物技术有限公司。

1.4 给药方法 术后3 h低、中、高剂量组分别给予中药汤剂0.5、1和2 mL/(100 g·d)灌胃，假手术组和模型组给予1 mL/(kg·d)生理盐水灌胃，正常组自由饮食。

2 实验方法

2.1 实验动物模型的建立 参照张朋奇等[1]报道的方法建立大鼠ICH模型。造模完成后注射用青霉素钠6万u肌肉注射，连续用4 d。假手术组操作过程同上，只进针不注血。

2.2 神经功能缺失评分 参照Zea-longa[3]的5分制方法进行。所有大鼠在麻醉清醒后即评定神经功能缺损程度，1次/d，直至断头处死为止。

2.3 标本处理 相应时间点过量麻醉大鼠，迅速开胸，暴露心脏，经左心室灌注固定，断头取脑，距针孔前后约2 mm位置处冠状切开，放入4%多聚甲醛中固定保存。

2.4 脑水含量测定 脑水含量采用干湿重法测定[4]。BWC(%)=(湿重-干重)÷湿重×100%。

3 实验结果

3.1 HE染色结果 正常组大鼠脑组织神经细胞胞浆、核染色均匀，核仁清楚，核膜完整，神经纤维束正常。假手术组大鼠脑组织HE染色:仅沿针道处可见数目极少的坏死细胞。ICH模型组及脑出血方高、中、低剂量组术后大鼠脑组织HE染色:第1天可见血肿形成，神经元及细胞间隙增宽，组织结构疏松，并有少量炎症细胞浸润。第3天各组脑水肿程度达到高峰,大量炎症细胞浸润。第7天神经元、胶质细胞肿胀及组织疏松明显减轻,各时间点脑出血方高、中、低剂量组与ICH模型组比较脑水肿程度明显减轻。

3.2 各组大鼠脑水含量的比较 见表1。

表1 各组不同时间脑水含量的变化(±s,n=24)

3.3 各组大鼠MMP-2阳性细胞表达的比较 见表2。

表2 各组不同时间MMP-2蛋白表达阳性细胞数比较(±s,n=24)

3.4 各组大鼠MMP-9阳性细胞表达的比较 见表3。

4 讨论

4.1 ICH后脑水肿的辨证论治 ICH后脑水肿的病机关键是“血瘀”，治疗时要抓住祛除血肿这个关键点[6]。因此,任继学提出了以破血化瘀为主的脑出血治疗大法。在“髓虚毒损”病机理论指导下，脑出血方中加入填精补髓的药物，使脑之气街及血海得脑气约束而气机条畅，体现了标本兼顾的原则。

表3 各组不同时间MMP-9蛋白表达阳性神经细胞数比较(±s,n=24)

4.2 破血化瘀填精补髓法对大鼠ICH后脑水含量的影响 实验结果显示，模型组在第1天血肿周围既可见明显脑水肿的发生，第3天达到高峰，7 d脑水含量已明显下降，高剂量组减少脑水含量最为明显，说明脑出血方具有明确的对抗ICH后脑水肿的作用。

4.3 破血化瘀填精补髓法对大鼠ICH后脑组织MMP-2/MMP-9表达的影响 MMPs是人体最主要的细胞外基质降解酶，MMP-2、MMP-9均是一组同源的。在ICH发生时,自身裂解、活化，破坏毛细血管外基质，从而破坏血脑屏障的完整性，引起脑水肿等一系列病理反应。本研究显示正常组未见MMP-2/MMP-9阳性染色细胞表达,假手术组仅见MMP-9阳性细胞的少量表达。模型组MMP-2阳性细胞在造模后1 d即发现MMP-2阳性细胞的明显表达,随时间逐渐增多，低、中、高剂量组表达水平明显低于模型组(P<0.05或P<0.01)；而MMP-9阳性细胞第1天开始表达，在第3天达高峰，第7天明显下降，高剂量组表达水平明显低于模型组(P<0.01)。所以，脑出血方可能通过抑制MMP-2/MMP-9表达而减轻脑水肿。

[1]张朋奇,朱贤立,赵甲山,等.一种大鼠脑内出血模型的建立与评价[J].中国临床神经外科杂志,2005,10(1):33-35.

[2]诸葛启钏.大鼠脑立体定位图谱[M].3版.北京:人民卫生出版社,2005.

[3]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[4]Gotoh O,Sano A,Koide T,et al.Isehemie brain edema following oeelusion of the middle cerebral artery in the rat[J].Stroke,1985,16(1):101-109.

[5]姚金文,赵德喜.出血性中风早期应用疏血通注射液验案分析[J].长春中医药大学学报,2008,24(3):300-300.

[6]赵德喜,于兰.破血化瘀法为主治疗出血性脑卒中临床研究[J].长春中医药大学学报,2012,28(6):975.