微小RNA-26b在乳腺癌中的作用及其分子机制研究

徐丽平，李 佳，房 林

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，根据美国2010年发布的数据，2009年全美女性新发乳腺癌207 090例,高居榜首，远超过第2位消化系统肿瘤125 790例，乳腺癌死亡共39 840例[1]。2003—2007年我国乳腺癌发病率41.64/10万，居女性癌症发病的第1位，死亡率 9.63/10万，居女性肿瘤死亡率的第6位[2]。因此乳腺癌已成为严重威胁全世界女性生命的疾病之一。研究表明微小RNA(microRNAs)是一组非编码RNA，通过作用于mRNA使其降解或抑制翻译，调控基因的表达，从而参与细胞的增殖、凋亡、细胞分化、肿瘤的侵袭转移以及肿瘤干细胞调控等[3-6]。微小RNA-26b(miR-26b)在肝细胞癌、肺癌、乳腺癌和膀胱癌等多种肿瘤中表达异常，其在不同肿瘤中扮演着癌基因或者抑癌基因的角色[7-11]。本研究采用荧光定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测miR-26b在乳腺癌及正常乳腺组织中表达水平，MTT法分析其对于乳腺癌MBA-MD-231细胞增殖的影响，并寻找其可能靶基因。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取上海市同济大学附属第十人民医院甲乳外科2010年1月—2012年5月术后病理确诊为乳腺癌的女性患者38例，年龄35～82岁，中位年龄52岁；术前均未行化疗、放疗及内分泌治疗。取乳腺癌组织，并取距离肿瘤组织>5 cm正常乳腺组织作为对照。随访时间为行手术治疗后至2013年4月，患者术后均接受化疗，目前均无复发转移。人乳腺癌MBA-MD-231细胞株购于中国科学院。

1.2 microRNAs提取和反转录 按照Tiangen公司miRcute microRNA提取分离试剂盒说明书进行操作。microRNAs反转录参照Chen等[12]的方法，通过特异茎环引物，按照下列顺序在PCR试管中加入反应物(体积为8.6 μl)：超纯水 2 μl，5×buffer 1.7 μl，microRNAs茎环引物(各个microRNAs及内参U6)1.9 μl，反转录酶(Primescript RT Enzyme MixI) 1 μl，microRNAs sample 2 μl。反应条件为：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 8 min，4 ℃ 10 min，反应结束后置于4 ℃冰箱保存。

1.3 实时定量RT-PCR 按照Takara公司SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time) DRR041A说明书完成加样，反应条件为95 ℃预变性2 min；变性95 ℃ 30 s，退火、延伸60 ℃ 45 s，重复35个循环，70～95 ℃绘制熔解曲线。反应结束后，RQ Manager分析软件统计处理，获取Ct值，并根据熔解曲线判断产物的纯度,结果分析根据Livak等[13]的描述，采用半定量分析。

1.4 细胞增殖检测 按照每孔5 000个细胞的密度将乳腺癌MBA-MD-231细胞种入96孔板。将接种好的96孔板细胞放入培养箱中培养，至细胞单层密度达到50%～60%。分组：采用50、100 nmol/L miR-26b mimics转染为50 nmol/L组和100 nmol/L组，参照Invitrogen公司lipofectamine说明书完成96孔板细胞转染；脂质体处理为空对照组，小分子RNA片段转染组为负对照组。按转染后24、48、72、96 h 4个时间段分别进行如下操作：每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/L)，继续培养4 h。吸取上清弃掉，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，置摇床上低速震荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值(OD)。

1.5 荧光素酶报告实验 通过TargetScan软件寻找miR-26b可能靶基因，前列腺素内过氧化物酶2(PTGS-2)3′UTR存在一个潜在miR-26b靶位结合点(257-264)。以人乳腺癌MBA-MD-231细胞cDNA为模板，按照Primer star kit(Takara)说明书PCR扩增包括miR-26b结合靶点在内的PTGS-2基因部分3′UTR区。PCR引物：正义引物5′-TAGGCGATCGCTCGAGCTGTTGCGGAGAAAGGAGTC-3′，反义引物 5′-AATTCCCGGGCTCGAGTAGTTACTTCTAATGCATCATGG-3′。将目的片段亚克隆到psiCHECK-2质粒上，酶切鉴定和测序分析其正确性。在96孔板中培养人乳腺癌MBA-MD-231细胞，当细胞密度为60%左右时进行转染，分别转染psiCHECK-2 PTGS-2 3′-UTR 和100 nmol/L miR-26b mimics(PTGS-2组)，psiCHECK-2/PTGS-2 3′-UTR 突变体 (200 ng) 和 miR-26b (100 nmol/L)(突变体对照组)，200 ng psiCHECK-2空载体和100 nmol/L miR-NC (空载体对照组)，每组设5个复孔。转染后继续培养48 h。根据Dual-luciferase report assay system (Promega,USA)说明书完成荧光素酶报告实验。

1.6 Western blotting 实验组为100 nmol/L miR-26b mimics转染组，空对照组为脂质体处理组，负对照组为小分子RNA片段转染组。转染后48 h分别收集实验组和对照组细胞，用预冷的RIPA裂解液裂解后取上清，以Bradford法蛋白定量，10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，然后电转移至硝酸纤维素(NC)膜上，分别加入1∶1 000稀释的PTGS-2一抗(BioVision,USA)，4 ℃孵育过夜，1∶1 000稀释的二抗稀释液中孵育，磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗膜后进行奥德赛系统扫描。

2 结果

2.1 实时定量RT-PCR结果 乳腺癌组织中miR-26b ΔCt为(15.25±0.98)，正常乳腺组织中为(12.37±1.23)，正常乳腺组织中miR-26b表达水平为乳腺癌组织的7.33倍，乳腺癌组织中miR-26b表达低于正常乳腺组织，差异有统计学意义(t=12.21,P=0.007)。

2.2 MTT实验结果 MTT实验结果显示，50 nmol/L组、100 nmol/L组、空对照组和负对照组转染后24、48 h相对细胞增殖比较，差异均无统计学意义(F值分别为1.314和1.830，P值分别为0.336和0.220)；4组转染后72、96 h相对细胞增殖比较，差异均有统计学意义(F值分别为11.037和5.470，P值分别为0.003和0.024)；其中转染后96 h 50 nmol/L组与空对照组比较，差异有统计学意义 (q=-3.048，P=0.038)；转染后72 h和96 h 100 nmol/L组与空对照组比较，差异均有统计学意义 (q值分别为-3.248和-4.254，P值分别为0.031和0.013,见图1)。

图1 不同组乳腺癌MBA-MD-231细胞相对细胞增殖比较

Figure1 Comparison of the proliferation of MBA-MD-231 cancer cells in different groups

2.3 荧光素酶报告实验 PTGS-2 mRNA在PTGS-2组中ΔCt为(3.91±0.21)，突变体对照组及空载体对照组中分别为(2.25±0.31)、(2.53±0.48)。荧光素酶报告实验结果显示，PTGS-2组、突变体对照组及空载体对照组荧光素酶活性比较，差异有统计学意义(F=99.88，P=0.000)；其中PTGS-2组较突变体对照组和空载体对照组均降低，差异有统计学意义(q值分别为-10.314和-12.108，P值分别为0.000和0.000，见图2)。

图2 不同组荧光素酶活性比较

Figure2 Comparison of luciferase activities of MBA-MD-231 cancer cells in different groups

2.4 Western blotting结果分析 与空对照组及负对照组相比，实验组作用乳腺癌MBA-MD-231细胞株48 h后，PTGS-2蛋白的表达量明显减少(见图3)。

图3 不同组PTGS-2蛋白表达情况

Figure3 PTGS-2 protein expression of MBA-MD-231 cancer cells in different groups

3 讨论

microRNAs是一类进化上高度保守的单链RNA，通常长度在22 nt左右,结合于靶基因mRNA的3′-UTR区域，阻遏翻译或者直接降解mRNA，抑制基因表达。在肿瘤发生和发展中，miRNA表达谱发生改变，抑制肿瘤的microRNAs表达下调，而促进肿瘤的microRNAs过表达。本实验发现miR-26b在乳腺癌组织和正常乳腺组织中差异表达，在乳腺癌组织中表达明显下调,这与在肝癌[7]、鼻咽癌[8]、原发性肺鳞状细胞癌[9]中的报道相一致。目前的研究表明miR-26b在多种肿瘤中具有多元的作用，如高表达的miR-26b可通过作用于COX-2(cyclooxygenase-2)明显抑制鼻咽上皮细胞癌细胞的增殖[8]，相反下调垂体肿瘤细胞中miR-26b的表达水平可抑制克隆形成、肿瘤侵袭和小鼠体内成瘤能力[10]。miR-26b通过抑制SLC7A11表达，促进乳腺癌细胞的凋亡，从而参与凋亡的调控过程[11]。本实验发现miR-26b能够抑制MBA-MD-231细胞的增殖,这些研究结果表明miR-26b在多种肿瘤的发生和演进中发挥着重要的作用。

PTGS-2催化花生四烯酸向前列腺素(PGs)和其他类花生酸类物质转化，其在正常组织中含量极少，缺氧、炎性细胞因子、促癌物、生长因子等可诱发其表达[14-15]。PTGS-2参与致癌、免疫反应抑制、细胞凋亡抑制、血管生成、肿瘤细胞的侵袭和转移等一系列生理病理过程。最近的研究表明，PTGS-2基因变异的女性好发乳腺癌[16-17]，此外，PTGS-2过度表达的乳腺癌患者预后较差[18]。这些研究表明PTGS-2参与肿瘤的形成和发展，其在乳腺癌中扮演着原癌基因的角色。本实验通过TargetScan预测miR-26b的下游靶基因，发现PTGS-2 3′UTR与miR-26b有着一处潜在的互补结合序列(257-264)，这为PTGS-2是miR-26b可能的靶基因提供了理论依据。荧光定量RT-PCR和Western blotting实验结果显示100 nmol/L miR-26b mimics抑制PTGS-2 mRNA和蛋白表达水平，且荧光素酶报告实验证明miR-26b能够下调PTGS-2组荧光素酶活性，这从实验基础上证明PTGS-2即是miR-26b的靶基因，miR-26b通过作用于PTGS-2基因参与乳腺癌细胞的增殖过程，这与Ji等[8]的报道相一致。

传统的乳腺癌治疗策略，主要包括外科手术、放疗、化疗和内分泌治疗等。microRNAs介导的肿瘤分子治疗将是根治肿瘤的重要发展方向。miR-26b在乳腺癌中的表达水平降低，能够抑制细胞增殖，提示其在乳腺癌中扮演着抑癌基因的角色，因此未来可通过上调miR-26b的表达，实现治疗乳腺癌的目的。梅玫等[19]研究发现聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)微粒可以实现5氟尿嘧啶(5-Fu)和miR-21的同载，联合应用5-Fu与miR-21抑制剂可有效抑制乳腺癌细胞的体外生长。因此未来可将5-Fu/PAMAM/miR-26b复合物应用于乳腺癌的临床治疗，这为克服肿瘤提供了新的方向。

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