人参二醇对鱼藤酮、MPP+诱导的PC12细胞损伤的作用

金晓蓉 孙馨 林筱洁 苗青 高瑞兰 方桂伦

人参二醇对鱼藤酮、MPP+诱导的PC12细胞损伤的作用

金晓蓉 孙馨 林筱洁 苗青 高瑞兰 方桂伦

目的 观察人参二醇对鱼藤酮、MPP+诱导的大鼠嗜铬细胞瘤损伤的影响。方法以大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞为研究对象，以鱼藤酮（0.3、1、3、10、30μmol/L）或MPP+（0.1、0.3、1、3mmol/L）诱导细胞损伤。设阴性对照组、人参二醇对照组（10、25、50、75、100mg/L）、鱼藤酮（3μmol/L，24h）或MPP+（1mmol/L，48h）组，人参二醇（10、25、50、75、100mg/L）联合鱼藤酮（3μmol/L）或MPP+（1mmol/L）组。采用MTT法检测细胞增殖活性；PI和Hoechst 33342染色检测细胞坏死和凋亡；并以免疫组织化学测定细胞酪氨酸羟化酶（TH）的表达。结果人参二醇（10、25、50、75、100mg/L）本身不会抑制PC12细胞增殖，其中50、75mg/L人参二醇还可促进细胞增殖；各浓度人参二醇对鱼藤酮诱导的细胞损伤均不具有保护作用；在MPP+处理诱导细胞损伤后，50、75mg/L人参二醇可提高细胞增殖活性，但人参二醇对细胞凋亡和坏死及TH的表达无影响。结论人参二醇（50、75mg/L）对MPP+诱导的PC12细胞损伤有保护作用，其作用机制与促进细胞增殖有关；人参二醇对鱼藤酮诱导的细胞损伤无明显保护作用。

人参二醇 鱼藤酮 MPP+ 大鼠 PC12细胞

【 Abstract】 ObjectiveTo evaluate the effects of panoxadiol on rat pheochromocytoma PC12 cell injury induced by rotenone or MPP+.MethodsPC12 cell injury was induced by rotenone(0.3,1,3,10,30μmol/L，24h)or MPP+ (0.1,0.3,1,3 mmol/L,48h).Panoxadiol(10,25,50,75,100 mg/L)was used to treat rotenone or MPP+induced PC12 cells.Cell proliferation was assessed by MTT method,cell necrosis and apoptosis was detected by flow cytometry with PI(propidium iodide)and Hoechst 33342 stain,respectively.The expression of tyrosine hydroxylase was measuared via immunohistostaining.ResultsPanoxadiol (10,25,50,75,100mg/L)had no affcts on proliferation of PC12 cells and had no protection effects on cell injury induced by rotenone.When PC 12 cell injury was induced by MPP+,panoxadiol(50,75 mg/L)promoted cell proliferation but had no effects on necrocytosis and apoptosis and the expression of tyrosine hydroxylase.ConclusionPanoxadiol(50、75 mg/L)might have protection effects on PC12 cell injury induced by MPP+,which may be related to facilitation of cell proliferation;however,panoxadiol has no protection effects on cell injury induced by rotenone.

帕金森病（Parkinson disease，PD）是一种常见的中老年退行性神经系统疾病，病因复杂，致残率较高。目前临床主要是多巴胺（dopamine，DA）替代治疗，该疗法不能阻止DA能神经元继续变性和凋亡，而且不良反应大。目前的神经元保护剂效果不佳，因此寻找安全有效的神经元保护剂很有必要。人参是传统的“补气”中药，现代研究发现人参具有抗衰老、抗肿瘤、提高机体免疫功能的作用。人参二醇（panoxadiol）是人参总皂苷中的有效成分，既往研究证实人参二醇对神经系统具有一定的保护作用。本研究以鱼藤酮、1-甲基-4-苯基吡啶离子（MPP+）诱导大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞损伤，制作PD神经元病变模型[1-2]，观察人参二醇对鱼藤酮、MPP+诱导PC12细胞损伤的影响，为PD的治疗开拓新的思路。

1 材料和方法

1.1 细胞株 高分化的PC12细胞购自中国科学院上海细胞所，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养，2～3d传代，对数生长期细胞用于实验。

1.2 主要试剂 人参二醇（批号：20091130）由浙江省中医院提供；二苯基四氮唑溴盐（MTT）、鱼藤酮、MPP+、胰酶、多聚赖氨酸、Propidium iodide（PI）和Hoechst 33342购自美国Sigma公司；高糖DMEM购自美国GIBCO公司，酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗体购自美国CHEMICON公司。

1.3 药物处理及分组

1.3.1 鱼藤酮处理组[1]细胞接种于96孔板或24孔板，贴壁生长24h后，吸去培养液，然后加入含不同浓度鱼藤酮（0.3、1、3、10、30 μmol/L）的全培养液，对照组换用全培养液后继续培养24h。实验分组如下：阴性对照组；鱼藤酮组（3μmol/L）；鱼藤酮（3μmol/L）+人参二醇（10、25、50、75、100mg/L）组；人参二醇对照组（10、25、50、75、100mg/L）。人参二醇在鱼藤酮给药前24h加药，并在鱼藤酮处理全过程持续给药。

1.3.2 MPP+处理组[2]细胞接种于96孔板或24孔板，贴壁生长24h后，吸去培养液，然后加入含不同浓度MPP+（0.1、0.3、1、3 mmol/L）的全培养液，对照组换用全培养液后继续培养48h。实验分组如下：阴性对照组；MPP+组（1mmol/L）；MPP+（1mmol/L）加人参二醇（10、25、50、75、100mg/L）；人参二醇对照组（10、25、50、75、100 mg/L）。人参二醇在MPP+给药前24h加药，并在MPP+处理全过程持续给药。

1.4 MTT测定细胞增殖活性[3]药物处理完毕后，吸弃96孔板中培养液，每孔加入100μl MTT（0.5mg/ml），继续孵育2h后，弃去培养液，每孔加入100μl二甲亚砜（DMSO），振荡10 min，待结晶完全溶解后，在酶标仪测定570 nm处吸光值，以各处理组吸光值与阴性对照组吸光值差值的百分比，计算存活细胞百分率。

1.5 PI和Hoechst 33342染色[3]将灭菌的盖玻片涂以多聚赖氨酸，吹干后,放入24孔板内进行细胞接种，待细胞长满玻片的80%～90%，作药物处理，洗涤后加PI和Hoechst 33342（终浓度均为0.01mg/ml），避光温浴10min，再洗2遍后，加用4%多聚甲醛固定10min，荧光显微镜观察并拍照。PI荧光为红色（620nm），Hoechst 33342荧光为蓝色（480nm）。细胞计数方法：24孔板每孔放置一玻片，40倍光镜下每一玻片计数3～7个独立视野，每个视野计数300个细胞以上，每一处理组计数3个复孔，共1 000个细胞以上。计数全部细胞数和荧光阳性细胞数，凋亡/坏死率（%）=（荧光阳性细胞数）/（全部细胞数）×100%。

1.6 免疫组织化学染色法测定细胞TH的表达[4]将灭菌的盖玻片涂以多聚赖氨酸，吹干后,放入24孔板内进行细胞接种，待细胞长满玻片的80%～90%，小心吸去培养液，用PBS漂洗2遍后，加入冰甲醇冰上固定5min，再用PBS漂洗3遍，加入5%正常羊血清室温封闭2h，取出封闭液后加入抗体稀释液1:500稀释抗TH抗体，置于湿盒4℃反应过夜，回收一抗后用PBS漂洗3遍，加入荧光标记二抗（anti-mouse IgG-Cy3，anti-Rabbit IgG-FITC，以PBS稀释为1:200），室温下避光反应2h，回收二抗并再用PBS漂洗3遍。稍干后用封片剂（甘油碳酸缓冲液：甘油=1∶1，加入1∶1 000 DAPI）5 μl封片，荧光显微镜下观察拍照，并计数细胞。细胞计数方法：24孔板每孔放置一玻片，40倍物镜下每一玻片计数3～7个独立视野，计数300个细胞以上，每组计数3个复孔，共1 000个细胞以上。计数全部细胞数和阳性细胞数，阳性率（%）=（阳性细胞数）（/全部细胞数）×100%。

1.7 统计学处理 采用Prism 4 for windows（Graph Pad Software Inc,USA）统计软件。计量资料用??表示。各组间方差齐时，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnett法；方差不齐时，多组间比较采用非参数单因素方差分析，两两比较采用Dunns法。

2 结果

2.1 人参二醇对鱼藤酮处理后PC12细胞活性的影响鱼藤酮处理后，PC12细胞增殖活性随鱼藤酮浓度的升高而下降（P＜0.05）。经预实验选择，采用鱼藤酮3μmol/ L处理24h，PC12细胞增殖活性为（66.8±3.31）%，与对照组（100±8.27）%比较，有统计学差异（P＜0.01）。而人参二醇不能逆转鱼藤酮诱导的细胞增殖活性下降，见表1。

2.2 人参二醇对鱼藤酮处理后PC12细胞TH表达的影响 鱼藤酮（3μmol/L）处理24h后，PC12细胞表达TH为（84.8±3.75）%，和阴性对照组（91.9±3.69）%比较，无统计学差异（P＞0.05）。人参二醇对PC12细胞的TH表达无影响（P＞0.05），见表2。

2.3 人参二醇对MPP+处理后PC12细胞增殖活性的影响 MPP+处理48 h后，PC12细胞增殖活性随MPP+浓度的升高而下降（P＜0.01），经预实验选择，采用MPP+ 1mmol/L处理48h作为损伤条件，处理后PC12细胞增殖活性为（84.2±4.40）%，与对照组（100±3.86）%比较，有统计学差异（P＜0.01）。人参二醇（25、50、75mg/L）单用可促进细胞增殖（P＜0.05或0.01），其中50、75 mg/L人参二醇可逆转MPP+诱导的细胞增殖活性下降（P＜0.01），见表3。

2.4 人参二醇对MPP+处理PC12细胞凋亡和坏死的影响 常规培养条件下，PC12细胞凋亡率为（6.38±1.83）%，坏死率为（0.89±0.75）%；MPP+（1mmol/L）处理48h后细胞凋亡和坏死增加，但和阴性对照组相比均无统计学差异（均P＞0.05）。50 mg/L人参二醇不能降低MPP+引起的细胞凋亡和细胞坏死，见表4。

表1 人参二醇对鱼藤酮处理后PC12细胞增殖活性的影响

表3 人参二醇对MPP+处理后PC12细胞增殖活性的影响

表4 人参二醇对MPP+处理后PC12细胞凋亡和坏死的影响（%）

2.5 人参二醇对MPP+处理后PC12细胞TH表达的影响 MPP+（1mmol/L）处理48h后，PC12细胞TH表达为（87.4±2.87）%，与阴性对照组（90.2±4.17）%相比，无统计学差异（P＞0.05）。50mg/L人参二醇对PC12细胞TH表达无影响（91.2±2.30）%，对MPP+作用后的TH表达（94.1±1.67）%亦无明显影响（均P＞0.05）。

表2 人参二醇对鱼藤酮处理后PC12细胞TH表达的影响

3 讨论

1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP）是一种神经毒素，它可以穿越血脑屏障，在单胺氧化酶B作用下转变为有毒性的MPP+后进入DA能神经末梢和胞体，选择性破坏黑质DA能神经元，致神经元变性死亡，这种细胞死亡的主要方式是细胞凋亡[5]。用MPP+制备的小鼠模型是目前最好的PD动物模型之一，已被广泛用于PD发病机制和治疗方法的研究[6]。本课题前期研究也发现PD模型组黑质致密带存活神经元数和DA能神经元减少。给予一定剂量的人参二醇预处理后，存活神经元数目增多且DA能神经元脱失现象减少，研究结果提示：人参二醇对小鼠PD模型损伤有一定程度的保护作用，此作用与人参二醇剂量有关，人参二醇（80、120mg/kg）作用明显。

鱼藤酮是鱼藤属植物的提取物，是农业生产中广泛使用的杀虫剂，可杀灭多种植物害虫。Betarbet等[7]在2000年首次使用鱼藤酮成功地诱导PD大鼠模型，受到了广泛关注。作为一种细胞毒性化合物，鱼藤酮主要的生化效应是抑制细胞呼吸链对氧的利用，造成内呼吸抑制。鱼藤酮对线粒体复合物Ⅰ有较强的亲和力，可选择性阻断铁-硫簇与泛醌Q的作用，中止线粒体呼吸链的正常运转，造成氧化应激及ATP生成障碍，线粒体膜通透性增加，大量释放凋亡刺激因子和凋亡诱导因子，激活Caspases酶系，引起细胞凋亡[8]。由于鱼藤酮能产生与PD流行病学和病理特征更为相似的表现，因而可能在机制上更接近与人类PD的自然病程[9]。Lapointe等[10]报道鱼藤酮的皮下给药引起大鼠全身毒性而非特异性神经系统DA神经元褪变。DA神经元的损伤程度在大鼠模型之间存在巨大的种源差异（从无到完全损伤）[7]，不同的大鼠种系对鱼藤酮的敏感性不同。推测可能是由于不同种系的神经胶质细胞种类及含量不同，星形胶质细胞含量多而小胶质细胞含量少的大鼠对神经毒性药物则有更大的耐受性[11]。

人参是传统的“补气”中药，具有“补气生血”作用，对人参的现代研究发现人参具有抗衰老，抗肿瘤，提高机体免疫功能的作用。前期研究已证实，人参二醇促进红、粒和巨核系的造血祖细胞增殖的作用明显，且对神经系统具有一定的保护作用。本研究结果提示：人参二醇对MPP+诱导的PC12细胞损伤具有保护作用，其作用机制与一定浓度下促进细胞增殖有关,而对鱼藤酮诱导的PC12细胞损伤无保护作用，对鱼藤酮处理后PC12细胞TH的表达无影响。本课题组将进一步深入研究，为人参二醇的的神经保护治疗机制提供更多实验依据。

[1] Siddiqui M A,Kashyap M P,Khanna V K,et al.Association of dopamine DA-D2 receptor in rotenone-induced cytotoxicity in PC12 cells[J].Toxicol Ind Health,2010,26(8):533-542.

[2] Cartelli D,Ronchi C,Maggioni M G,et al.Microtubule dysfunction precedes transport impairment and mitochondria damage in MPP+-induced neurodegeneration[J].J Neurochem,2010,115 (1):247-258.

[3] Huang X J,Zhang W P,Li C T,et al.Activation of CysLT receptors induces astrocyte proliferation and death after oxygen-glucose deprivation[J].Glia,2008,56(1):27-37.

[4] Feng L,Meng H,Wu F,et al.Olfactory ensheathing cells conditioned medium prevented apoptosis induced by 6-OHDA in PC12 cells through modulation of intrinsic apoptotic pathways[J]. Int J Dev Neurosci,2008,26(3-4):323-329.

[5] Tatton N A,Kish S J.In situ detection of apoptontic nuclei in the substantia nigra compacta of 1-methyl-4phenyl-1,2,3,6-trrahydropyridine-treated mice using terminal deoxynucleotidy transferase labelling and acridine orange staining[J].Neuroscience,1997,77(4):1037-1048.

[6] Chen S D,Xu D L,Yu H Z,et al.Study on 1-methyl-4-phenyl-1, 2,3,6-tetrahydro-pyridine induced Parkinson's disease animal model[J].Chin Med J,1990,70(5):252-254.

[7] Betarbet R,Sherer T B,Mackenzie G,et al.Chronic systemic pesticide exposure reproduces features of Parkin's disease[J]. Nat Neurosci,2000,3(12):1301-1306.

[8] Richardson J R,Quan Y,Sherer T B,et al.Paraquat neurotoxicity is distinct from that of MPTP and rotenone[J].Toxicol Sci,2005,88 (1):193-201.

[9] Greennamyre J T,Betarbet R,Sherer T B.The rotenone model of Parkinson's disease:genes.Environment and mitochondria[J]. Parkinsonism Related Dis,2003,9(Suppl 2):s59-s64.

[10] Lapointe N,St-Hilaire M,Martinoli M G,et al.Rotenone induces non-specific central nervous system and system and systemic toxicity[J].FASEB J,2004,18(6):1096-1118.

[11] Smeyne M,Jiao Y,Sheperd K R,et al.Glia cell number modulates sensitivity to MPTP in mice[J].Glia,2005,52(2):144-152.

Effects of panoxadiol on PC12 cell injury induced by rotenone or MPP+

PanoxadiolRotenone MPP+ RatPC12 cell

2013-03-20）

（本文编辑：胥昀）

浙江省卫生厅中医药科技研究项目基金资助（2008CA115）

322000 义乌市中心医院内科（金晓蓉、方桂伦）；浙江省中医院血液病研究所（孙馨、林筱洁、苗青、高瑞兰）