多形性脑胶质母细胞瘤中1p/19q杂合性缺失的表达及其意义

楼林 方晴霞 郑小春 茹国庆 马杰 卢刚

多形性脑胶质母细胞瘤中1p/19q杂合性缺失的表达及其意义

楼林 方晴霞 郑小春 茹国庆 马杰 卢刚

目的探讨多形性胶质母细胞瘤（GBM）中1p/19q杂合性缺失（1p/19q LOH）的表达类型及其意义。方法通过荧光原位杂交法检测29例GBM、17例间变性星形细胞瘤（AA）和12例少突星形细胞瘤（OA）中1p/19q LOH的表达及其差异。结果GBM、AA和OA中1p/19q LOH的发生率分别为24.1%、35.3%和75.0%，其中同时发生1p和19q LOH的比率分别为13.8%、23.5%和66.7%，GBM中1p/19q LOH的发生率明显低于AA和OA（P＜0.05）。GBM的VEGF阳性表达率和Ki-67增殖指数分别为75.9%和87.66±16.21，AA为47.1%和49.57±4.73，OA为41.7%和41.62±4.25，GBM与后两者比较，均有统计学差异（均P＜0.05）。1p/19q LOH的发生率与VEGF阳性表达和Ki-67增殖指数呈负相关（均P＜0.05）。结论1p/19q LOH的表达可能有助于评估GBM患者对烷化剂类药物治疗的敏感性及其预后。

多形性胶质母细胞瘤 1p/19q杂合性缺失 化疗 预后

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the loss of heterozygosity of 1p and/or 19q chromosomal arms(1p/19q LOH)in glioblastoma multiforme(GBM)and its significance.MethodsThe 1p/19qLOH patterns in 29 cases of GBM,17 cases of anaplastic astrocytoma(AA)and 12 cases of oligodendroglioma(OA)were examined by using fluorescence in situ hybridization (FISH)method.Results1p/19q whole loss was observed in 13.8%of GBM cases,23.5%of AA and 66.7%of OA.The rate of 1pLOH or 19qLOH in GBM,AA and OA cases was 24.1%,35.3%and 75.0%respectively.The 1p/19qLOH rate in GBM was significantly lower than that in AA and OA(P＜0.05).The positive expression of VEGF and Ki-67 proliferating index(Ki-67 PI)were 75.9%and 87.66±16.21 in GBM,47.1%and 49.57±4.73 in AA and 41.7%and 41.62±4.25 in OA respectively.The positive expression of VEGF and Ki-67 PI in GBM was significantly higher than that in AA and OA groups(P＜0.05).The 1p/19qLOH was negatively correlated with expression of VEGF,and Ki-67 PI(P＜0.05).ConclusionThe 1p/19qLOH may be an useful genetic marker to estimate chemotherapeutic sensitivity and prognosis of GBM.

近年来，肿瘤耐药因子O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6-methylguannine-DNA methyltransferase，MGMT）已成为多形性胶质母细胞瘤（glioblastoma multiform，GBM）化疗有效性的分子标记物，但随着研究的深入，MGMT的局限性和可靠性问题日益显现，因此寻找新的可靠的标记物成为GBM研究的焦点。根据国内外的研究现状，本研究检测染色体1p/19q在GBM、间变性星形细胞瘤（anaplastic astrocytoma，AA）及少突星形细胞瘤（oligodendroglioma，OA）样本中的表达，并结合临床探讨1p/19q杂合性缺失（1p/19q loss of heterozygosity，1p/ 19q LOH）作为治疗有效性辅助指标的意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选取2010-09—2012-03在本院手术切除并经病理证实的58份肿瘤组织标本，其中19份为低温冰箱保存的液氮速冻标本，39份为手术直接获取的新鲜肿瘤组织。其中GBM29例，男26例，女3例，年龄27～41岁；AA17例，男9例，女8例，年龄29～62岁；OA12例，男9例，女3例，年龄19～57岁。

1.2 方法

1.2.1 组织学检查 肿瘤组织标本4%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规3μm切片，HE染色，按2007年《WHO中枢神经系统肿瘤分类》的诊断分类标准确定肿瘤的病理类型和级别。

1.2.2 免疫组织化学检查 采用免疫组化S-P法检测胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、S-100蛋白（S-100）、神经微丝（neurofilament，NF）、突触素（synaptophysin，Syn）、少突胶质细胞转录因子-2（oligodendrocyte transcription factor-2，Olig2）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及Ki-67。标本固定、切片后，DAB显色，苏木素复染。GFAP、NSE、S-100、NF、Syn和Olig2常规用于GBM、AA和OA的病理诊断，以细胞膜及细胞质黄染为阳性；VEGF以细胞膜及细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性细胞，阳性细胞数≥5%为阳性表达，＜5%为阴性表达。Ki-67阳性细胞为细胞核呈颗粒状棕黄色，Ki-67增殖指数（proliferation index,PI）以高倍镜下1 000个细胞中阳性细胞的百分率来表示。

1.2.3 荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH） 肿瘤标本常规固定、切片，采用荧光原位杂交1p/19q双色探针试剂盒（LSI 1p36/1q25和19q13/19p13双色探针，Vysis公司）检测标本中1p/19qLOH。在荧光显微镜下选取主要的异常区域，观察200个细胞中细胞质内靶信号（TS）=0/1及对照信号（CS）≥1的信号表达，1p/19q的正常表达为TS（红色）2点，CS（绿色）2点，即TS=2，CS=2。1p/19qLOH的表达为：TS=0/1，CS≥1；1p/ 19q表达失衡为TS≥2，CS≥3或TS＜CS；其它类型的1p/19q表达异常包括TS＞CS、单倍体和多倍体等。判读计数结果，杂合性维护（heterozygosity in maintenance，MH）的阳性标准为1p/19q正常表达细胞的百分率≥20%。

1.3 统计学处理 采用SPSS16.0统计软件。计量资料均以表示，组间比较采用方差分析，计数资料的组间比较采用χ2检验和Fisher确切概率法。

2 结果

2.1 组织学诊断 根据患者的临床表现、组织学检查和免疫组化（GFAP、NSE、S-100、NF、Syn和Olig2）结果，29例GBM中原发性17例、继发性12例，其中按WHO分级Ⅲ～Ⅳ级5例、Ⅳ级24例；17例AA中星形细胞瘤4例（WHOⅡ级）、AA 13例（WHOⅡ～Ⅲ级）；12例OA中OA8例（WHOⅡ级）、间变性OA4例（WHOⅡ～Ⅲ级）。

2.2 免疫组化结果 GBM的VEGF阳性率75.9%（22/29），AA为47.1%（8/17），OA为41.7%（5/12），GBM与AA、OA间均有统计学差异（均P＜0.05），AA和OA间无统计学差异（P＞0.05）。GBM的Ki-67 PI平均（87.66±16.21）%，AA平均（49.57±4.73）%，OA平均（41.62±4.25）%。GBM明显高于AA和OA，均有统计学差异（均P＜0.05）。

2.3 1p/19qLOH 29例GBM中，7例（24.1%）符合1p/ 19qLOH的阳性标准，其中2例1pMH，1例19qMH，4例（13.8%）同时发生1pLOH和19qLOH（图1，见插页）。17例AA中，6例（35.3%）符合阳性标准，其中2例1pMH，4例（23.5%）同时发生1pLOH和19qLOH。12例OA中，9例（75.0%）符合阳性标准，其中1例1pMH，8例（66.7%）同时发生1pLOH和19qLOH。GBM中1p/19qLOH的发生率以及同时发生1pLOH和19qLOH的比率明显低于AA和OA（均P＜0.05）。

2.4 1p/19qLOH与VEGF、Ki-67 PI的关系 GBM肿瘤细胞1p/19qLOH的发生率与VEGF阳性表达和Ki-67 PI均呈负相关（r=-0.643或-0.847，均P＜0.05），而VEGF阳性表达与Ki-67 PI呈正相关（r=0.921，P＜0.05），见表1。

表1 不同肿瘤细胞免疫组化和1p/19qLOH结果的关系比较

3 讨论

脑胶质瘤是一种环境诱导的多因素疾病，基因组稳定性丧失和免疫监控能力低下是伴随整个肿瘤发生过程的两个重要标志性事件。由于恶性脑胶质瘤是一类分子水平高度异质性的疾病，即便组织学形态相同，由于其分子遗传学的差异最终可导致治疗反应和预后的不同，因此，基于分子病理分型的个体化治疗是未来的治疗方向。目前获得公认的预测脑胶质瘤疗效和生存预后的分子病理分型标志物有：1p/19qLOH、MGMT失活和EGFR-P13K通路激活[1-2]。

1p/19qLOH是OA相对特异性的一种分子遗传学改变。早在1992年，Ransom等[3]的研究证实了在OA中存在染色体1p和19qLOH。1998年，Cairncross等[4]首次报道了间变性OA中1p/19qLOH对临床治疗的意义，1pLOH的OA患者对PCV方案联合化疗敏感，同时发生1p和19qLOH的患者对化疗的敏感性更高，治疗的总有效率达60%～70%，生存时间明显长于同级别的AA。此后众多的相关研究也证实，不同级别的OA发生1p/19qLOH的百分率基本相同，而相应级别的其他星形细胞瘤发生1p/19qLOH的百分率明显降低；1p/19qLOH阴性患者的中位生存时间为2～3年，而1p/19qLOH阳性患者的中位生存时间可长达6～7年[5-6]。本研究GBM、AA和OA中1p/19qLOH的发生率分别为24.1%、35.3%和75.0%，其中同时发生1p和19qLOH的百分率分别为13.8%、23.5%和66.7%，与文献报道基本相同。

GBM是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤之一，目前的研究发现，GBM发生时的基因丢失遍布整个基因组，影响到几乎所有的染色体，其中10号染色体上等位基因缺失的发生率最高[7]。研究表明，GBM发生10qLOH提示预后不良，而1p/19qLOH，尤其是1p和19qLOH同时发生则表示GBM可能对放、化疗敏感，预后相对较好。多数研究同时发现，GBM中1p/19qLOH同时发生的概率远远低于OA[8]。本研究中，GBM中符合1p/19qLOH的阳性标准的达24.1%，而同时发生1p/19qLOH百分率仅为13.8%。虽然1p和19q的分子遗传学背景以及1p/ 19qLOH患者预后较好的原因至今尚不清楚，甚至1p和19q位点的基因检测也未发现相关的抑癌基因，但是1p/ 19qLOH可能提示GBM对化疗敏感且预后相对较好[8]。

VEGF是目前发现作用最强、特异性最高的促进肿瘤血管生成因子，主要与肿瘤的侵袭性生长特性有关，其表达主要受p13K/AKT信号转导途径的调控。Yao等[9]研究发现，与VEGF阴性的胶质瘤相比，VEGF阳性的低级别星形细胞瘤和胶质母细胞瘤的生存期明显缩短。此外，相应的抗VEGF单克隆抗体也是分子靶向治疗中一个研究热点。在一项贝伐单抗联合伊立替康治疗复发性GBM的Ⅱ期临床研究中，35例患者中有57%获得部分缓解，中位生存时间42周，有7例患者完成1年治疗，其中6例患者的PET检查提示肿瘤病灶呈低代谢状态[10]。本研究显示，GBM中VEGF的阳性率明显高于AA和OA，且与代表胶质瘤恶性程度及肿瘤细胞增殖活性的Ki-67 PI呈正相关，而与1p/19qLOH的百分率呈负相关。这表明肿瘤血管内皮细胞随着胶质瘤恶性程度的增加而显著增生，并间接的促进肿瘤的生长；而随着肿瘤恶性程度的增高，肿瘤细胞本身的增殖速率也明显升高。因此，VEGF和Ki-67 PI可以作为临床上评估GBM侵袭性生长特性、恶性进展程度以及治疗反应的客观指标。

本研究认为，GBM中发生1p/19qLOH意味着肿瘤细胞对化疗敏感且患者的预后相对较好，因此，1p/ 19qLOH的百分率可作为GBM化疗药物敏感性及其预后评估的合适指标，而治疗前后VEGF和Ki-67 PI的动态监测则有助于对个体化治疗的效果做出客观评估。

[1] Figarella-Branger D,Colin C,Coulibaly B,et al.Histological and molecular classification of gliomas[J].Res Neurol,2008,164(6): 505-515.

[2] Pallini R,Ricci V L,Banna G L,et al.Cancer stem cell analysis and clinical outcome in patient with glioblastoma multiforme[J]. Clin Cancer Res,2008,14(24):8205-8212.

[3] Ransom D T,Ritland S R,Moertel C A,et al.Correlation of cytogenetic analysis and loss of heterozygosity studies in human diffuse astrocytomas and mixed oligo-astrocytomas[J].Genes Chromosomes Cancer,1992,5(3):357-374.

[4] Cairncross J G,Ueki K,Zlatescu M C,et al.Specific genetic predicators of chemotherapeutic response and survival in the patients with anaplastic oligodendrogliomas[J].J Natl Cancer Inst,1998,90(12):1473-1479.

[5] Felsberg J,Erkwoh A,Sabel M C,et al.Oligodendroglial tumors: refinement of candidate regions on chromosome arm 1p and correlation of 1p/19q status with survival[J].Brain Pathol,2004, 14(2):121-130.

[6] Durand K S,Guillaudeau A,Weinbreck N,et al.1p/19q loss patterns and expression of p53 and olig2 in gliomas:relation with histological types and prognosis[J].Mod Pathol,2010,23(5):619-628.

[7] Okezie O O,Hughes B,Di C,et al.Glioblastoma multiforme oncogenomics and signaling pathways[J].Clin Med Oncol,2009, 3(1):39-52.

[8] Pinto L W,Araujo M B,Vettore A L,et al.Glioblastoma:correlation between oligodendroglial components,genetic abnormality and prognosis[J].Virchows Arch,2008,452(4):481-490.

[9] Yao Y,Kubota T,Sato K,et al.Prognostic value of VEGF and its receptors Flt-1 and Flk-1 in astrocytic tumors[J].Acta Neurochir (Wien),2001,143(2):159-166.

[10] Vredenburgh J J,Desjadins A,Herndon J E,et al.Bevacizumab plus irinotecan in recurrent glioblatoma multiforme[J].J Clin Oncol,2007,25(30):4722-4729.

Loss of heterozygosity of 1p/19q in glioblastoma multiforme and its significance

GBM 1p/19qLOH ChemotherapyPrognosis

2013-03-04）

（本文编辑：胥昀）

浙江省卫生厅医药卫生科技计划项目（Y201233656）

310014 杭州，浙江省人民医院神经外科（楼林、卢刚），药学部（方晴霞、郑小春），病理科（茹国庆、马杰）

卢刚，E-mail：lugg@msn.cn