8-OH-DPAT对弥漫性脑损伤及合并二次脑损伤大鼠神经元凋亡的影响

李 宾，宋振全，梁国标，赵 旭，毛振立，李晓明，吕 伟，雷 伟，蒋 为

我们前期的研究证实8-OH-DPAT在大鼠创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)后能够通过降低脑温抑制神经元的凋亡［1］。国外研究报告显示5-HT1A受体激动剂在多种脑损伤模型中具有神经保护作用，能够促进运动、认知功能的恢复及减轻脑组织病理学表现［2－4］。然而，8-OH-DPAT对TBI后神经元凋亡的影响研究还不充分［5－6］，并且8-OHDPAT对二次脑损伤的影响未知。我们制作二次脑损伤模型，研究8-OH-DPAT对大鼠弥漫性脑损伤及合并二次脑损伤后的神经元凋亡的影响。

材料与方法

1 实验分组

182只(330±25)g健康雄性Wister大鼠随机分为6组:空白对照组(A组，n=7)，假手术组(B组)，单纯DBI+NS对照组(C组)，单纯DBI+8-OH-DPAT治疗组(D组)，DBI合并SBI+NS对照组(E组)，DBI合并SBI+8-OH-DPAT治疗组(F组);B、C、D、E、F各组根据伤后取脑时间分为6、12、24、72、168h亚组，各亚组7只，n=35。A组不做任何损伤，B组除了不接受铁棒打击和双侧颈总动脉结扎其余手术操作同E组，DBI模型参照Marmarou方法制作，DBI后稳定15min，结扎大鼠双侧颈总动脉30min，做成缺血性二次脑损伤模型。

2 药物应用及取材

A、B组不使用任何药物;D、F组在DBI 15min后腹腔注射8-OH-DPAT(0.5mg/kg)［2－4］，8-OHDPAT(5mg/支)购自美国Sigma公司;C、E组在DBI 15min后腹腔注射等体积的NS;E、F组注射药物或NS后再施加二次损伤。到达时间点后，常规方法取脑、石蜡包埋，备做切片。

3 观察指标

将每只大鼠随机抽取5张切片分别观察以下指标，每张切片任取5个视野在400倍光镜下观察，取其平均值。

3.1 苏木精-伊红(HE)染色观察前额皮层病理表现。

3.2 TUNEL法检测前额皮层细胞凋亡:凋亡检测试剂盒购买自北京中衫金桥公司，求出每张切片各视野的凋亡指数(凋亡指数=凋亡细胞数/细胞总数×100%)。

3.3 免疫组化检测前额皮层神经元Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白的表达:抗体购于美国Santa Cruz公司。应用Image-Pro Plus 6.0软件(Media Cybernetics公司)观察各组切片Caspase-3、Bcl-2、Bax阳性表达的积分光密度(integral optical density，IOD)值并进行比较。

4 统计分析

实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS 18.0统计软件进行单因素方差分析，P＜0.05为差异有显著性意义。

结 果

1 HE染色可见A、B组无损伤表现;C、D、E、F组有明显的脑组织水肿、神经元变性、细胞数目减少、毛细血管充血、炎细胞浸润，与A、B组比较E组损伤最为明显，D组表现最轻;D组用药后损伤较C组减轻，F组较E组也有减轻(见图1)。

图1 各组72h亚组前额皮层病理表现(HE×400)

2 A、B组凋亡细胞少见，阳性反应为细胞核染色呈明确棕黄色，A组凋亡指数为(1.36±0.14)%，各损伤组于损伤后6h即可见凋亡细胞，逐渐增多，72h时达高峰，第7d仍有较高的表现;D组用药后较C组降低(P＜0.05或P＜0.01)，同样可见F组小于E组(P＜0.01)(见表1，图2)。

3 Caspase-3阳性反应为胞浆内棕黄色颗粒，A、B组Caspase-3阳性表达少见;与A、B组比较，各损伤组各时间点阳性表达明显增多(P＜0.01)，尤其在损伤后72h增多最明显(P＜0.01);D组用药后较C组表达减少(P＜0.05或P＜0.01)，同样可见F组表达低于E组(P＜0.05或P＜0.01)(见表2，图3)。

4 Bax阳性表现为胞浆内黄染颗粒，A、B组Bax阳性表达少见;与A、B组比较，各损伤组各时间点脑损伤后Bax表达明显增多(P＜0.01)，72h可见高峰，7d后有所降低;D组用药后表达较C组降低(P＜0.05或P＜0.01)，同样可见F组表达低于E组(P＜0.05或P＜0.01)(见表3，图4)。

5 Bcl-2阳性表现同Bax，A、B组即可见Bcl-2的少量表达;各损伤组6h Bcl-2表达可见增多，24h达高峰，之后逐渐减少;与A、B组比较，各损伤组各时间点Bcl-2阳性表达明显增多(P＜0.01);D组用药后较C组促进了Bcl-2的表达(P＜0.05或P＜0.01)，同样F组表达高于E组(P＜0.05或P＜0.01)(见表4，图5)。

表1 各组不同时间点凋亡指数(%)观察结果

表2 各组不同时点Caspase-3阳性表达情况比较(IOD)

表3 各组不同时点Bax的表达结果统计(IOD)

表4 各组不同时点Bcl-2的表达结果统计(IOD)

图2 各损伤组72h亚组细胞凋亡表现(TUNEL染色 ×400)。镜下见凋亡细胞胞体缩小，核膜皱缩，染色质浓缩，浓集于核膜附近，核内出现棕黄色颗粒，核不规则、固缩块状浓染呈棕黄色

图3 各损伤组72h亚组脑组织Caspase-3的表达(免疫组织化学染色 ×400)。镜下见胞浆有黄染，尤其是核膜周围黄染最为明显，D、F组用药后Caspase-3的表达减少

图4 各损伤组72h亚组前额皮层Bax的表达(免疫组织化学染色 ×400)。可见各损伤组胞浆有黄染，E组表达最为明显，D组表现最轻(只在核膜周围可见)

图5 各损伤组24h亚组前额皮层Bcl-2的表达(免疫组织化学染色 ×400)。上图神经元及胞核清晰可见，各组在胞浆内均有Bcl-2蛋白的表达，尤其在核膜周围有大量的聚集

讨 论

DBI是临床常见的TBI类型，主要以非手术综合治疗，尚缺少针对神经元凋亡的有效药物治疗。TBI后除了最初的损伤还有二次的脑损伤［3］，最初的损伤是不可逆的，比如损伤区域的细胞坏死，然而低氧、低血压等二次损伤因素会持续几分钟到几小时甚至更久，这为药物发挥作用提供了时机。在临床工作中二次脑损伤很常见，即便是在重症监护室二次损伤因素依然难以避免［4］。通过后期治疗尽可能减弱或阻止二次损伤的发生，可提高患者的功能预后。2001年Kline等［7］第一次报道了5-HT1A受体激动剂在TBI中的神经保护作用，后续的一些实验主要集中于观察大鼠运动和认知功能的恢复［2－4］。研究认为8-OH-DPAT提供的这种神经保护作用与抑制谷氨酸盐释放、抑制细胞外钙离子内流、引起神经元超极化、保护脑组织多巴胺及胆碱能神经系统等有关［2－4，7］。

DBI及SBI模型制作方便，实验设备简单，便于操作，稳定重复性好。HE染色观察可见脑组织水肿，细胞水肿、变性坏死，血管充血，炎细胞浸润，C、E盐水对照组损伤比相应的D、F药物组损伤重，说明8-OH-DPAT具有神经保护作用，和一些研究的结果是相吻合的［1－4］。

Caspase-3在细胞凋亡中具有重要作用，在Caspases家族中处于核心位置，是Caspase家族中最重要的凋亡执行者［8］。活化的Caspase-3能特异性地切割DNA，使参与DNA损伤修复过程的聚ADP核糖聚合酶(PARP)以及DNA依赖的蛋白激酶(DNA-PK)等失活，促使染色质凝聚和核酶激活，导致细胞凋亡［1］。若细胞中检出活化的Caspase-3和(或)细胞TUNEL染色(+)则有细胞凋亡存在［9］。Adayev等［5］研究5-HT1A G蛋白偶联抑制Caspase-3其可能机制见图6。实验显示给予8-OH-DPAT后，细胞凋亡减少，Caspase-3表达降低，表明8-OHDPAT可通过减少Caspase-3表达，抑制DBI后的细胞凋亡同时能够减弱二次损伤。

Bcl-2的过量表达可以抑制凋亡发生，主要通过稳定线粒体膜阻止线粒体释放Caspase、凋亡诱导因子和细胞色素C等作用抑制细胞凋亡［10］。Bax可与Bcl-2形成异源二聚体使凋亡易于发生［11］，同时Bax可以促进细胞色素C的释放，从而激活Caspase-3诱导细胞凋亡的发生，因此Bax高表达可能是颅脑损伤后细胞凋亡增加的主要原因。两者对细胞凋亡调控作用相反，认为它们之间可能存在一种平衡共同调节细胞凋亡［1］。Hsiung等［6］研究8-OH-DPAT抑制AC从而阻断Caspase-3的活化途径，其可能机制见图7。实验观察了8-OH-DPAT对大鼠脑损伤后前额皮质Bcl-2及Bax表达的影响，结果发现其可在一定程度上提高Bcl-2的表达，同时抑制Bax的表达，说明8-OH-DPAT可通过调节Bax/Bcl-2的表达抑制细胞凋亡，发挥神经保护作用。

图6 5-HT1A受体激动剂抑制Caspase-3的可能机制

图7 8-OH-DPAT抑制Bax/Bcl-2的可能机制

实验证实了8-OH-DPAT可抑制DBI后的细胞凋亡，同时对SBI有一定的抑制作用，研究8-OHDPAT对细胞凋亡的影响，有助于为临床治疗DBI及防治SBI提供参考依据。8-OH-DPAT通过抑制Caspase-3蛋白表达、降低Bax表达、促进Bcl-2的表达发挥其抗凋亡作用。本实验的用药方式、时间及剂量参照以往的研究，存在一定的局限性，例如用药是在脑损伤15min后，这在临床很难实现，需要更进一步的研究。8-OH-DPAT抑制凋亡的机制是多方面的，还需进一步探索。

［1］Mao ZL，Song ZQ，Li Gi，et al.8－hydroxy－2－(di－npropylamino)tetralin intervenes with neural cell apoptosis following diffuse axonal injury［J］.Neural Regeneration Res，2013，8(2):133－142.

［2］Kline AE，Zafonte RD，Cheng JP，et al.A delayed and chronic treatment regimen with the 5－HT1A receptor agonist 8－OH－DPAT after cortical impact injury facilitates motor recovery and acquisition of spatial learning［J］.Behavioural Brain Resh，2008，194(1):79－85.

［3］Yelleswarapu NK，Tay JK，Kline AE，et al.Elucidating the role of 5－HT1A and 5－HT7 receptors on 8－OH－DPAT－induced behavioral recovery after experimental traumatic brain injury［J］.Neurosci Lett，2012，515(2):153－156.

［4］Henderson KA，Kline AE，Sozda CN，et al.Evaluation of a combined therapeutic regimen of 8－OH－DPAT and environmental enrichment after experimental traumatic brain injury［J］.J Neurotrauma，2010，27(11):2021－2032.

［5］Adayev T，Ray I，Sondhi R，et al.The G protein－coupled 5－HT1A receptor causes suppression of caspase－3 through MAPK and protein kinase Calpha［J］.Biochem Biophys Acta，2003，1640(1):85－96.

［6］Hsiung SC，Tin A，Tamir H，et al.Inhibition of 5－HT1A receptor－dependent cell survival by cAMP/protein kinase A:role of protein phosphatase 2A and Bax［J］.Neurosci Res，2008，86(10):2326－2338.

［7］Kline AE，Yu J，Horvath E，et al.The selective 5－HT(1A)receptor agonist repinotan HCL attenuates histopathology and spatial learning deficits following traumatic brain injury in rats［J］.Neuroscience，2001，106(3):547－555.

［8］Thornberry NA，Lazebnik Y.Caspases:enemies within［J］.Science，1998，281(5381):1312－1316.

［9］Clark RS，Kochanek PM，Watkins SC，et al.Caspase－3－medeiated neuronal death after traumatic brain injury in rats［J］.J Neurochem，2000，74(2):740－753.

［10］Fiskum G.Mitochondrial participation in ischemic and traumatic neuronal cell death［J］.Neurotrauma，2000，17(7):843－845.

［11］莫纪华，郑秀珏，杨小锋.大鼠严重脑损伤后细胞凋亡状态及相关基因Bcl－2、Bax的表达［J］.中华创伤杂志，2004，20(7):432－433.