浙江汉族长寿人群血脂水平及ApoB基因Xba I-RFLR和3’-VNTR多态性的相关性研究*

盛爱萍，　周　标，　施　达，　沈　毅

(1金华职业技术学院, 浙江 金华 321017;2浙江省疾病预防控制中心, 浙江 杭州 310051;3金华市疾病预防控制中心，浙江 金华 321002; 4浙江大学，浙江 杭州 310058)

根据2007年8月公布的《中国成人血脂异常防治指南》[1]指出,血清总胆固醇(total cholesterol,TC)或低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)升高是冠心病和缺血性脑卒中的独立危险因素之一。而载脂蛋白B (apolipoprotein B,ApoB)参与体内的脂质代谢，是LDL-C的主要蛋白质成分。本文研究浙江汉族长寿人群的血脂水平及ApoB基因XbaI-限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)和3’-可变数目串联重复序列(variable-number tandam repeat,VNTR)多态性对血脂四项和载脂蛋白水平是否有影响，希望能进一步了解长寿发生的机制。

材　料　和　方　法

1研究对象

研究对象均为汉族，采用以人群为基础的多组病例-对照研究设计，病例共有2组，一组为长寿老人组(≥90岁)96人；另一组为长寿老人组的子女104人。共设立2组对照，一组选同长寿老人组子女的年龄、职业、性别、经济收入和居住地相匹配的人群104人为对照，另一组选同长寿老人组子女的年龄、性别相匹配的非长寿老人组(寿命小于70岁)的子女95人为对照。完成长寿老人组体格检查和血样采集共80份，有效率为83.3%(80/96)。在长寿老人组家庭中，选择长寿老人组的子女104人，完成体格检查和血样采集共90份，有效率为86.5%(90/104)。完成正常对照组体格检查和血样采集共89份，有效率为85.6%(89/104)。完成非长寿老人组的子女体格检查和血样采集共87份，有效率为90.6%(87/95)。最终完成共计346份。

2方法

2.1一般指标、ApoB与血脂四项测定由当地卫生院结合农村健康体检对研究对象进行身高、体重、血压、血糖等项目检查和血样采集，研究对象于清晨空腹状态下静脉采集2.5 mL全血，静置后分离血清，送当地医院检验科检测ApoB和血脂四项:TC、甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和LDL-C。ApoB检测采用ApoB检测试剂盒，注册证书编号为浙食药监械(准)字2006第2400247号，产品标准YZB/浙1332-2006。血脂四项指标检测采用日立BM717全自动生化分析仪，德国Centronic试剂。仪器用厂家配套的校准品校准，各项目均采用有效的质量控制措施，严格按照说明书操作。

2.2基因多态性分析基因组DNA抽提采用改良盐析法。应用 PCR方法扩增ApoB基因第26外显子，上、下游引物分别为：5′-ACC GGC CCT GGC GCC CGC CAG CA-3’和5′-AGC AGC AAG AGT CCA CCA ATC-3’。采用PxE Thermal Cycler 5.0扩增仪进行扩增， PCR扩增后，用10 U限制性内切酶XbaI于37 ℃水浴消化4 h。在琼脂糖凝胶中电泳后观察紫外灯下带型。出现1条长度为359 bp的条带，为X-X-纯合子；出现359 bp、229 bp和130 bp 3条带，为X+X-杂合子；出现229 bp和130 bp 2条带，为X+X+纯合子,见图1。

Figure 1. The result ofApoBgeneXbaI RFLP genotyping.M:marker；0,3,4: X-X-；2,5:X+X+；1,6:X+X-.

图1ApoB基因XbaIRFLP分型结果

应用 PCR方法扩增ApoB基因3’端 VNTR重复序列，上、下游引物分别为：5′-AAC GGA GAA ATT ATG GAG GG-3’和 5′-GCA CAT GAA GAC ACC AGA GG-3’。将PCR产物冷却，置4 ℃保存。分型采用 PCR扩增的 DNA片段电泳法。以已知长度的DNA片段为标准，对等位基因进行分级。以核心序列的重复次数为标准，对等位基因进行命名。串联重复序列的拷贝数=(片段长度-151 bp)/15 bp。不同的等位基因可组合成不同的基因型，见图2。

Figure 2. The result ofApoBgene 3’-VNTR genotyping. M:marker;fragment length of 22 is 480 bp，copy numberof repeat sequences=(480-151) bp/15 bp；fragment length of 24 is 510 bp，copy number of repeat sequences =(510-151) bp/15 bp；and so on.

图2ApoB基因3’-VNTR分型结果

3统计学处理

采用EpiData 3.1软件建立数据库。正态分布计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示,组间均数比较用方差分析，两两比较用SNK-q检验；偏态分布计量资料用中位数(四分位数间距)表示,组间比较采用Kruskal-Wallis检验；计数资料用2检验。进一步采用多元线性回归分析长寿与对照组在各体格检查指标上的差异。采用SPSS 16.0软件进行统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

1人口学特征

长寿老人、长寿子女、正常对照和非长寿子女4组在性别上差异无统计学意义;长寿子女组、正常对照组与非长寿子女组在年龄、文化程度和独居生活上差异均无统计学意义,见表1。

表1　长寿及对照组的人口学特征

Age,education and living alone in the children of longevous elders，normal control group and the children of non-longevous elders were not significant different (P>0.05)

2体格检查结果比较

除了肝功能以外，4组人群在下述各体检指标上均存在显著差异。各组的两两比较采用SNK法，身高为长寿老人<长寿子女=正常对照=非长寿子女；体重和体重指数(body mass index,BMI)均为长寿老人<长寿子女=正常对照<非长寿子女；收缩压为长寿老人=非长寿子女=正常对照<长寿子女；舒张压为长寿老人=长寿子女<正常对照=非长寿子女；血糖为长寿老人=正常对照=非长寿子女>长寿子女；TC为长寿老人=非长寿子女>正常对照>长寿子女；TG为长寿子女<长寿老人=正常对照<非长寿子女；HDL-C为长寿老人=长寿子女>正常对照>非长寿子女；LDL-C为长寿老人=长寿子女<正常对照=非长寿子女；ApoB为长寿老人=长寿子女<正常对照<非长寿子女,见表2。

表2　长寿及对照组体检特征

The data of ALT and TG were expressed as median (interquartile range) and compared using Kruskal-Wallis test.

3长寿及对照组体检特征的多元线性回归

考虑到4组在社会人口学特征上还存在着分布上的差异，在多元线性回归中，以正常对照组为参照，控制了年龄、性别、民族、独居及教育等社会人口学因素的影响，进一步了解长寿与对照在体检特征上的差异。

以正常对照组为参照，非长寿子女组在BMI上的回归系数β=0.978(P<0.05)，也就是说，BMI与非长寿呈正相关，表明BMI增大不利于长寿；长寿老人及长寿子女组收缩压、舒张压和血糖的回归系数均为负值，其中长寿子女组有统计学意义，也就是说，收缩压、舒张压和血糖与长寿呈负相关，表明高血压及高血糖不利于长寿；长寿子女组TC、TG、LDL-C及ApoB的回归系数均为负值，且除TC外，其余均有统计学意义，也就是说，上述指标与长寿呈负相关，表明这些指标的升高不利于长寿。非长寿子女TC、TG、LDL-C及ApoB的回归系数均为正值，且除LDL-C外，其余均有统计学意义，表明上述指标与非长寿呈正相关，同样说明这些指标的升高不利于长寿；长寿子女组HDL-C的回归系数均为正值，且有统计学意义(P<0.01)，也就是说，HDL-C与长寿呈正相关，表明HDL-C升高有利于长寿,见表3。

4长寿及对照组ApoB基因多态性特征

ApoB的XbaI-RFLP有3种基因型：X-X-、X+X-及X+X+。4组中以X-X-基因型为主，分别占86.2%、86.7%、87.6%和86.2%，其次是X+X-基因型，分别占12.5%、13.3%、12.4%和13.8%。X+X+基因型只在长寿老人中发现1例。4组在3种基因型的分布上差异无统计学意义(P>0.05)。等位基因4组均以X-等位基因为主，分别占92.5%、93.3%、93.8%和93.1%。4组在等位基因的分布上也没有显著差异(P>0.05)。

ApoB基因3’-VNTR多态性基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，等位基因共有15种, 最大的等位基因是HVE 52，最小的等位基因是HVE 22。以HVE 38为界，可将等位基因分为小等位基因(HVE<38)和大等位基因(HVE≥38)。4组中小等位基因分别占96.2%、96.7%、85.4%和80.0%，长寿人群及其子女小等位基因所占比例较高,差别有统计学意义(P<0.01),见表4。

5不同基因型间血脂及ApoB水平比较

拥有X+X-基因型的人，其TC、TG、LDL-C及ApoB均高于拥有X-X-基因型的人，且除TG外，均有统计学意义(P<0.01)。与此相反，拥有X+X-基因型的人，其HDL-C低于拥有X-X-基因型的人，差别有统计学意义(P<0.01)。拥有X+X-基因型的人ApoB含量显著高于拥有X-X-基因型的人(P<0.01)。

表3长寿及对照组体检特征的多元线性回归

Table 3. Multiple liner regression of physical characteristics in longevity and control groups

Variableβ(SE)StandardizedβPBMI　Longevouselders-1．200(1．140)-0．180>0．05　Childrenoflongevouselders0．330(0．407)0．051>0．05　Childrenofnon⁃longevouselders0．978(0．474)0．151<0．05SBP　Longevvouselders-1．808(3．112)-0．039>0．05　Childrenoflongevouselders-6．980(3．255)-0．139<0．05　Childrenofnon⁃longevouselders0．495(3．783)0．010>0．05DBP　Longevouselders-7．397(4．568)-0．275>0．05　Childrenoflongevouselders-6．163(1．632)-0．239<0．01　Childrenofnon⁃longevouselders2．637(1．896)0．106>0．05ALT　Longevouselders0．091(0．124)0．129>0．05　Childrenoflongevouselders0．011(0．044)0．017>0．05　Childrenofnon⁃longevouselders0．077(0．052)0．112>0．05GLU　Longevouselders-0．101(0．571)-0．030>0．05　Childrenoflongevouselders-0．607(0．204)-0．189<0．01　Childrenofnon⁃longevouselders0．389(0．237)0．120>0．05TC　Longevouselders0．077(0．550)0．128>0．05　Childrenoflongevouselders-0．335(0．196)-0．106>0．05　Childrenofnon⁃longevouselders0．574(0．228)0．180<0．05TG　Longevouselders0．269(0．692)0．065>0．05　Childrenoflongevouselders-0．516(0．247)-0．131<0．05　Childrenofnon⁃longevouselders0．626(0．287)0．157<0．05HDL⁃C　Longevouselders0．022(0．056)0．050>0．05　Childrenoflongevouselders0．119(0．020)0．277<0．01　Childrenofnon⁃longevouselders-0．043(0．023)-0．098>0．05LDL⁃C　Longevouselders0．148(0．106)0．186>0．05　Childrenoflongevouselders-0．136(0．038)-0．179<0．01　Childrenofnon⁃longevouselders0．071(0．044)0．092>0．05ApoB　Longevouselders0．006(0．075)0．009>0．05　Childrenoflongevouselders-0．132(0．027)-0．227<0．01　Childrenofnon⁃longevouselders0．101(0．031)0．172<0．01

表4　长寿及对照组ApoB基因多态性特征

ApoB基因3’-VNTR大等位基因与小等位基因在血脂及ApoB的水平上也存在着差异。拥有大等位基因的人，其TC、TG、LDL-C及ApoB均高于拥有小等位基因的人，且差异均有统计学意义(P<0.01)。而HDL-C在拥有大等位基因的人体内含量较低，差别有统计学意义(P<0.01)。从ApoB的含量上看，拥有大等位基因的人含量显著高于拥有小等位基因的人(P<0.01),见表5。

表5　不同基因型间血脂及ApoB水平比较

**P<0.01vsX-X-;##P<0.01vsVNTR<38.

讨　　论

血脂是血浆中的中性脂肪和类脂的总称, 广泛存在于人体中，它们是生命细胞的基础代谢必需物质。本文研究发现，长寿老人HDL-C含量高于其它3组，而LDL-C含量低于正常对照及非长寿子女组，TC含量也比正常对照及非长寿组要低，这与许多研究结果[2-3]一致，表明HDL-C升高有利于长寿, TC、TG和LDL-C的升高不利于长寿，进一步证实了血脂与长寿有着密切的关系，这可能是因为除HDL-C以外的血脂水平升高会导致冠心病与脑卒中风险增大，进而成为长寿的危险因素。

多数研究[4]证实，ApoB基因XbaI位点是载脂蛋白和血脂表型的相关位点，其多态性与血清脂质水平及ApoB水平密切相关，但不同基因型对不同血脂代谢的影响存在争议。Boekholdt等[5]发现X+等位基因与较高水平的LDL-C及ApoB有关，而与冠心病的发病风险呈负相关。Puri等[6]的发现则与之有所不同，冠心病组中X-X-基因型频率显著高于正常对照组(P<0.05)，且冠心病组中X-X-基因型与增高的血清ApoB及LDL-C相关，而与其它血脂异常无明显相关，提示X-等位基因与冠心病发病有一定相关性。在Benn等[7]的研究中，X+基因型与增高的总胆固醇、LDL-C和ApoB有显著相关性(P<0.01)。姜文锡等[8]报道ApoB基因型X+X+与自然长寿呈显著正相关。本文的研究结果显示ApoB基因XbaI-RFLP与长寿之间并没有统计学意义上的关联，拥有X+X-基因型的人，其TC、TG、LDL-C及ApoB均高于拥有X-X-基因型的人，拥有X+X-基因型的人，其HDL-C低于拥有X-X-基因型的人，表明拥有X-X-基因型的人血脂水平较健康。

ApoB基因3’-VNTR对血脂、脂蛋白和载脂蛋白水平是否有影响，目前国内外观点尚不一致。有学者认为冠心病人群中ApoB基因3’-VNTR与任何血脂变量都没有关系[6]。姜文锡等[9]在维吾尔族人群的研究发现，长寿组中HVE 36和HVE 42频率显著高于对照组(P<0.05)，并且HVE 44、HVE 46、HVE 48和HVE 58仅见于长寿组，而HVE 26、HVE 30和HVE 34显著低于对照组(P<0.05)。Garasto等[10]和Jemaa等[11]认为带有3’-VNTR大等位基因较带有小等位基因的个体更易患血脂代谢异常性疾病。国内孟康等[12]对老年高脂血症患者的研究表明，患者中3’-VNTR大等位基因频数明显多于对照组，且TC、LDL-C和HDL-C水平与ApoB基因型增大相关，表明ApoB基因3’-VNTR多态性可能是影响血脂水平的遗传因素之一。我们认为，ApoB基因3’-VNTR与血脂水平有密切关系，拥有小等位基因的人的TC、TG、LDL-C及ApoB各指标都较低，同时显示长寿人群及其子女小等位基因所占比例较高(P<0.01)，其可能的机理是：ApoB基因 3’-VNTR十分接近PolyA信号，有可能通过影响PolyA腺苷化，进而干扰mRNA的稳定性，从而影响其表达。也可能是3’-VNTR大等位基因与ApoB基因某一功能性核苷酸序列改变有连锁不平衡，直接影响脂质代谢从而增加心脑血管疾病的易感性。

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