肾组织preS1/S2-Ag检测在乙型肝炎病毒相关性肾炎诊断中的作用*

石成钢,　胡爱玲,　曾晓琳,　尹琼丽,　李　梅,　程桂凤

(中山大学附属第三医院肾内科，广东 广州 510630)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染呈世界性分布，我国为HBV感染大国，HBV导致的肾炎在继发性肾炎中占据相当大的比例，但是对于乙型肝炎病毒相关性肾小球肾炎(hepatitis B virus-associated glomerulonephritis，HBV-GN)的诊断及发病机制还存在着很多争议，目前国内外关于HBV-GN还没有统一的诊断标准。1989年“北京乙型肝炎病毒相关肾炎座谈会”制定了我国首个HBV-GN的诊断标准[1]：(1)血清HBV抗原阳性；(2)患肾小球肾炎，并可除外狼疮肾炎等继发性肾小球疾病；(3)肾组织中找到HBV抗原。其中，第3点为必备条件。2000年全国肾活检病理诊断研讨会[2]提出HBV-GN的免疫病理表现为肾小球内有HBsAg、HBcAg或HBeAg沉积。但此诊断标准存在2个主要问题：(1)肾组织切片中虽然找到HBV或其抗原，但HBV或其抗原并未致病，而是合并其它肾小球肾炎；亦可能由于含HBV的血液污染肾组织标本所致假阳性而致误诊；(2)确系HBV-GN，但由于HBV激活肾脏损伤后，肾活检时肾组织中已无HBV或其抗原或者是对HBV及其抗原进行染色时出现假阴性而导致漏诊[3]。

对乙型肝炎的研究提示HBV是通过前S区(preS)与肝细胞膜位点结合进入肝脏致病的， 前S1(preS1)是病毒复制指标，前S1/S2抗原(preS1/S2 antigen,preS1/S2-Ag)具有强免疫原性。那么，preS1区可能介导HBV进入肾组织细胞，也可通过自身较强的免疫原性产生免疫反应，在HBV-GN致病机制中发挥作用。对该机制的深入研究及证实，须首先明确在合并有HBV感染的患者肾组织中有无preS的表达。因此，本研究旨在通过免疫组织化学方法检测HBV-GN患者肾组织中preS1/S2(1～176 aa)抗原的表达，探讨肾组织preS抗原及其它HBV抗原检测在HBV-GN诊断中的应用价值。

材　料　和　方　法

1材料

1.1病例选择回顾性研究2003年1月至2013年1月于中山大学附属第三医院住院治疗并送检肾脏病理检查的患者。病例组49例患者，男性37例，女性12例，年龄16～55岁，入组病例病理类型：膜性肾病(membranous nephropathy，MN)17例，膜增生性肾小球肾炎(membranoproliferative glomerulonephritis,MPGN)6例，IgA肾病 (IgA nephropathy，IgAN)13例，系膜增生性肾小球肾炎(mesangioproliferative glomerulonephritis，MsPGN)3例，增生硬化性肾小球肾炎(proliferativesclerosing glomerulonephritis，SPGN)8例，肾小球轻微病变(glomerular minimal-change di-sease，MCD)2例。

1.1.1病例组(1)血清学HBsAg(+)，HBsAb(-)；(2)有血尿、蛋白尿等临床表现；(3)经肾组织活检病理明确诊断为肾小球肾炎。

1.1.2对照组1(非肾小球肾炎组)肾癌3例，肾结石2例：(1)血清学HBsAg(+)，HBsAb(-)；(2)病理诊断为肾结石或肾癌等非肾小球肾炎疾病。

1.1.3对照组2(非乙肝组)5例：(1)血清学HBsAg(-)；(2)肾组织活检病理诊断为肾小球MCD。

剔除标准：(1)系统性红斑狼疮；(2)过敏性紫癜；(3)糖尿病；(4)血清学HCV-IgG(丙型肝炎病毒IgG抗体)阳性。合并有以上可导致继发性肾小球疾病病因的患者均予剔除。

1.2主要试剂和仪器兔抗人PreS1/S2-Ag多克隆抗体购自R&D，鼠抗人HBeAg单克隆抗体购自Fitzgerald，鼠抗人HBsAg和HBcAg单克隆抗体工作液购自Novocastra，EnVision试剂盒购自DAKO，NovoLink试剂盒购自Novocastra，HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb血清学检测试剂购自深圳华康生物工程有限公司，血清HBV-DNA检测购自广州市达安基因公司的试剂，抗HCV-IgG购自中山生物工程有限公司；组织切片图像采集系统由Nikon Eclipse 80i正置显微镜、数码相机用控制器Nikon digital sight DS-U2和显微摄像图像处理软件NIS Elements BR 2.30(Nikon)采集组织切片图像构成。

2方法

2.1临床检验患者尿常规、血清肌酐、24 h尿蛋白定量及血清免疫学指标为入院后常规送检，抗原抗体检测均采用ELISA，由中山大学附属第三医院检验科完成。采用real-time PCR检测血清HBV-DNA，检测下限1×106copies/L，由中山大学附属第三医院感染科实验室完成。

2.2肾组织内preS1/S2-Ag和HBcAg的检测采用免疫组化方法：石蜡切片贴于硅化玻片上，置55 ℃烤箱1 h，而后置恒温箱过夜；二甲苯(微波炉低火档)脱蜡5 min×3次；经无水乙醇脱水5 min、再经95%乙醇、80%乙醇脱水各3 min；蒸馏水冲洗5 min 2次， 3%双氧水微波炉低火档处理3 min消除内源性生物素；蒸馏水冲洗5 min 2次，在电磁炉上加热EDTA溶液(pH 8.0)至沸腾后将组织芯片放入，盖上锅盖，待上气后2 min，停止加热，迅速冷却；PBS冲洗3次，每次5 min，甩去载玻片上多余液体，用DAKO笔在载玻片上圈住所需染色蜡片，圈内滴加胃酶孵育15 min；PBS冲洗3次，每次5 min，以除去完成消化的胃酶，滴加Ⅰ抗(兔抗人preS1/S2-Ag多克隆抗体稀释度为1∶80；HBcAg工作液)，阴性对照采用PBS代替Ⅰ抗，置37 ℃恒温培养箱孵育40 min；PBS冲洗3次，每次5 min，以除去未结合的Ⅰ抗，滴加Novocastra封闭剂，置37 ℃恒温培养箱孵育20 min；PBS冲洗3次，每次5 min，以除去未结合的Ⅰ抗，滴加NovoLink聚合物，置37 ℃恒温培养箱孵育20 min；PBS冲洗3次，每次5 min，DAB显色3 min，置显微镜下观察，控制显色程度，清水冲洗中止反应10 min；苏木素复染细胞核1 min，清水冲洗返蓝10～20 min；95%乙醇水化1 min，置于55 ℃烤箱1 h；二甲苯透明5 min，中性树脂封固。

2.3肾组织内HBeAg和HBsAg的检测采用EnVision免疫组化法：蜡切片贴于硅化玻片上，置55 ℃烤箱1 h后恒温箱过夜； 二甲苯(微波炉低火档)脱蜡5 min×3次；经无水乙醇脱水5 min、再经95%乙醇、80%酒精脱水各3 min；蒸馏水冲洗5 min 2次， 3%双氧水微波炉低火档处理3 min消除内源性生物素；蒸馏水冲洗5 min 2次，在电磁炉上加热EDTA溶液(pH 8.0)至沸腾后将组织芯片放入，盖上锅盖，待上气后2 min，停止加热，迅速冷却；PBS冲洗3次，每次5 min，甩去载玻片上多余液体，用DAKO笔在载玻片上圈住所需染色蜡片，圈内分别滴加Ⅰ抗(小鼠抗人HBsAg单克隆抗体工作液，小鼠抗人HBcAg单克隆抗体工作液，小鼠抗人HBeAg单克隆抗体稀释度1∶30)，37 ℃恒温培养箱孵育60 min，阴性对照采用PBS代替Ⅰ抗；PBS冲洗3次，每次5 min，以除去未结合的Ⅰ抗，滴加Envision聚合物，置37 ℃恒温培养箱孵育20 min；PBS冲洗3次，每次5 min，DAB显色3 min，置显微镜下观察，控制显色程度，清水冲洗暂停反应10 min；苏木素复染细胞核1 min，清水返蓝5 min；95%乙醇水化1 min，置于55 ℃烤箱1 h；二甲苯透明5 min，中性树脂封固。

采用2例慢性活动性乙型肝炎肝组织作为阳性对照组。

2.4结果判定根据2000年肾活检病理诊断标准指导意见[2]：肾小球内抗原沉积视为阳性。在光镜下见淡黄色细颗粒视为弱阳性(+)，棕黄色颗粒视为阳性(++),褐黄色粗颗粒视为强阳性(+++)[4]。

3统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件进行统计分析，计数资料比较采用卡方检验或Fisher确切概率法，配对计数资料比较采用McNemar检验，计数资料相关性分析采用双变量Spearman等级相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

14种抗原的定位与分布

PreS1/S2-Ag阳性物质呈棕黄色颗粒，在肾脏中主要表现为胞浆型，阳性细胞呈局灶型分布，阳性细胞可见于肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞、内皮细胞及肾小球上皮细胞；HBsAg和HBeAg阳性物质与preS1/S2-Ag类似，也表现为胞浆型。HBcAg阳性物质呈细颗粒状，主要位于核内，部分病例位于胞浆内或核浆联合存在，少数位于胞膜上,见图1～4。

Figure 1. Expression of preS1/S2-Ag in renal tissues of patients with HBV-GN (immunohistochemical staining). A: PBS control (×400); B: positive expression of preS1/S2-Ag (×100).

图1PreS1/S2-Ag在肾组织中的表达

Figure 2. The positive expression of HBsAg in glomeruli (immunohistochemical staining,×400).

图2HBsAg在肾小球的阳性表达

Figure 3. The positive expression of HBcAg in renal tissues (immunohistochemical staining).A:×100;B:×400.

图3HBcAg在肾组织的阳性表达

Figure 4. The positive expression of HBeAg in renal tissues (immunohistochemical staining).A:×100;B:×400.

图4HBeAg在肾组织中的阳性表达

249例患者抗原检出情况

采用免疫组化检测肾组织中乙型肝炎病毒相关抗原，preS1/S2-Ag阳性16例，阳性率32.7%，HBeAg阳性19例，阳性率38.8%，HBsAg阳性7例，阳性率14.3%，HBcAg阳性23例，阳性率46.9%；preS1/S2-Ag与HBcAg检出率有显著差异(P<0.01)，且相关分析显示preS1/S2-Ag的检出与HBcAg呈正相关(P<0.01)，其余无相关性，见表1。

表1患者HBeAg、HBsAg和HBcAg检出率与preS1/S2-Ag检出率的比较及相关性分析

Table 1. Comparison and correlation analysis of HBeAg, HBsAg and HBcAg positive rates with preS1/S2-Ag positive rate in patients(n=49)

HBVantigen+-Positiverate(%)Comparison(vspreS1/S2⁃Ag)Correlation(vspreS1/S2⁃Ag) 2PrPPreS1/S2⁃Ag163332．7HBeAg193038．80．248>0．050．071>0．05HBsAg74214．30．000>0．050．036>0．05HBcAg232646．912．55<0．010．459<0．01

3病理类型与抗原检出的关系

在49例入选病例中4种抗原至少有1项检测为阳性的有36例，4种抗原均为阴性的有13例。根据抗原检出情况我们将49例患者分为阳性组(即HBV-GN组)和阴性组(即肾炎合并HBV感染组)，病理类型统计如下：HBV-GN组总计36例，其中MN 14例， IgAN 8例，SPGN 6例，MPGN 4例，MsPGN 3例，MCD 1例;肾炎合并HBV感染组总计13例，其中MN 3例，SPGN 2例，IgAN 5例，MCD 1例，MPGN 2例，MsPGN 0例。病理类型与HBV抗原表达无明显相关性(r=0.176，P>0.05)。

在49例乙肝病毒感染合并肾炎的患者中，4种抗原总体检出率膜性肾病82.4%，膜增生性肾病66.7%，IgA肾病61.5%，系膜增生性肾炎100%，轻微病变50%，增生硬化性肾病75%。由于病例数较少，各病理类型各种抗原检出率差异性未做统计分析,见表2。

4乙肝相关性肾炎与其它肾病各抗原表达情况的比较

将确诊乙肝肾炎的36例患者与5例其它肾病的患者进行比较，其它肾病组有2例表达HBeAg，1例表达HBcAg，无1例表达preS1/S2-Ag及HBsAg，见表3。

讨　　论

HBV的外膜由S-ORF编码合成，包括3种外膜成分：大蛋白、中蛋白和主蛋白HBsAg。主蛋白HBsAg由226个氨基酸组成，中蛋白是在主蛋白的氨基端外加55个氨基酸，扩加部分为preS2，大蛋白是在中蛋白的氨基端再增加119个氨基酸，增加部分即为preS1[5]。PreS1蛋白暴露于病毒表面，是与肝细胞膜接触的前哨[6],有多个B细胞及T细胞表位[7]。针对这些抗原表位已制作出多种多、单克隆抗体，目前商品化抗体中较容易获得的是preS1/S2(1～176 aa)，其携带的抗原表位最多，因此我们选用该试剂对肾组织中的preS1/S2抗原进行了检测。

表249例入选病例各病理类型的抗原检出情况

Table 2. Antigen detection in the 49 cases of patients with diffe-rent pathological types

PathologicaltypePreS1/S2⁃Ag，HBeAg，HBsAgorHBcAgpositivePreS1/S2⁃Ag，HBeAg，HBsAgandHBcAgnegativeTotalMPGN426MN14317IgAN8513MCD112MsPGN303SPGN628Total361349

r=0.176,P>0.05. Due to fewer cases, unable to carry out various types of pathology detection rate among the comparison.

表3乙肝相关性肾炎与其它肾病各抗原表达情况的比较

Table 3. Comparison of various antigen expression in patients with hepatitis B virus-associated glomerulonephritis and other nephropathies

　GroupPreS1/S2⁃AgHBeAgHBsAgHBcAg+-+-+-+-HBV⁃GN162019177292313MCD05050505Others05230514

MCD (non-hepatitis B group): 5 cases of glomerular minimal-change disease; others (non-nephritis group): 5 cases of other nephropathies (kidney cancer or kidney stone disease).

我们对49例HBV血清学阳性的患者应用免疫组化的方法检测肾组织中preS1/S2-Ag与HBsAg和HBeAg的一致性较好，但检出率低于HBcAg。实验结果中，36例HBV-GN肾组织中preS1/S2-Ag阳性，阳性颗粒主要存在于肾小管的上皮细胞胞浆中，而在肾小球内皮细胞、系膜细胞及上皮细胞胞浆中也可见表达。PreS1/S2-Ag的检出阳性率为32.7%，与其它传统HBV抗原HBsAg(阳性率14.3%)和HBeAg(阳性率38.8%)比较无明显差异，提示preS1/S2-Ag与HBsAg、HBeAg的一致性较好，而与HBcAg(阳性率46.9%)比较，检出率有显著差异；在与其它3种抗原的关联性分析中发现，preS1/S2-Ag与其它HBV抗原总的检出率存在关联，且与HBcAg相关性较强。HBcAg存在于细胞内，为细胞内抗原，仅在细胞受损时才从胞内释出，因此肾组织中存在HBcAg难以用来自于血液循环中的抗原或抗原抗体复合物沉积解释[8-10]，故对HBV-GN的诊断意义较大。在5例HBsAg血清学阴性肾小球轻微病变患者肾组织中并没有检出preS1/S2-Ag及其它HBV抗原。在5例其它非肾小球肾炎患者肾组织中有2例HBsAg阳性，1例HBcAg阳性，没有检出preS1/S2-Ag。综合上述结果说明preS1/S2-Ag可以在肾脏中存在，可能是导致HBV-GN发生的致病抗原之一。当然，本研究中preS1/S2-Ag并未显示较高的敏感性，可能有几方面的原因：一是可能选择的preS1/S2-Ag抗体是多克隆抗体，其它抗体采用的是单克隆抗体，抗原抗体结合的效能没有优势；二是选择的preS1/S2-Ag抗体针对的区段为1～176位氨基酸，这种抗体在包含preS1的抗体中是否反应原性最优，目前尚无定论。但在膜性肾病组中，有1例患者4种抗原检测仅preS1/S2-Ag检出，提示对这类患者联合preS1/S2-Ag检测或可提高诊断的敏感性。

HBV-GN的病理类型，儿童以膜性肾病为主，成人以膜性和膜增生性肾病为主[3]。我们的研究在49例患者中检出至少1项抗原阳性有36例，根据1989年及2000年病理诊断标准，该36例病人可视为HBV-GN。我们观察到在36例HBV-GN的病理类型组成中，以膜性肾病比例最高，占38.9%，与文献报道一致[3]，膜增生性肾小球肾炎在我们的研究中比例仅为11.1%。在14例膜性肾病中preS1/S2-Ag、HBeAg和HBcAg的阳性检出率分别为35.7%(5/14)、50.0%(7/14)和64.3%(9/14)。一般认为膜性肾病主要是由HBeAg原位免疫复合物在基底膜的沉积所致[3]。因此，我们认为对于HBV肾病HBeAg是重要的致病抗原，应重视对它的检测。HBV膜性肾病与原发性膜性肾病不同，通常可见系膜细胞和内皮细胞的增生，系膜区增宽。PreS1不仅具有较强的免疫原性，同时具有反式转录激活功能[11-12]，不排除存在一条通过preS1的反式激活效应导致系膜细胞及内皮细胞增殖的途径可能，但这需要进一步研究证实。

研究结果提示4种抗原在HBV相关IgA肾病(HBV-associated IgA nephritis，HBV-IgAN)中均有检出，preS1/S2-Ag和HBsAg阳性患者HBcAg均可检出，但阳性率低于后者，HBeAg则与HBcAg有较好互补性。近年HBV-IgAN相关的研究呈上升趋势，方一卿等[10]的研究中68例HBV-GN患者，IgA肾病(51.5%)比例高于膜性肾病(38.2%)。在我们的研究中IgA肾病占22.2%，仅次于膜性肾病38.9%。近年来研究认为HBV感染与IgA肾病关系密切，汪年松等[13]调查了100例IgAN患者，血清HBsAg阳性18例(18%)均高于普通人群的HBsAg携带率。其后对168例IgA肾病患者进行检测中，血清HBsAg阳性32例(19.05%)；肾组织HBAg 阳性59例(35.12%)，HBV-Ag在肾小球中检出的阳性率为30.36%(51/168)[14]。循环免疫复合物(circulating immune complex，CIC)沉积在HBV-IgAN发病机制中得到较为一致的公认。研究认为，HBV感染人体后，可能与其体内的血清抗体在血循环中形成免疫复合物，主要为HBsAg-CIC和HBcAg-CIC。HBsAg和HBcAg的相对分子质量较大，带负电荷，其CIC无法穿透肾小球基底膜而沉积于上皮下，故CIC主要沉积在系膜区和内皮下。HBeAg分子量小，且HBeAg相关免疫复合物在血液中可以暂时解离，故HBeAg容易直接穿过肾小球基底膜种植于上皮下，与循环中的相应抗体在上皮下结合，形成原位免疫复合物[3]。本研究中8例IgA肾病患者中4例检出HBeAg，或可认为原位免疫复合物沉积也可能是参与HBV-IgAN致病的因素。

本研究是回顾性收集患者的临床资料，故部分患者资料不够完整。研究中以免疫组化对preS1/S2-Ag等HBV相关抗原的表达进行了检测，若能从电镜、原位杂交、Southern印迹杂交等多角度印证实验，则结果将更为严谨。今后可从基础研究的角度进一步探讨preS1/S2-Ag对肾脏致病的机制研究。

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