益气解毒中药减少单纯疱疹病毒性角膜炎复发的免疫机理研究

关瑞娟 亢泽峰 李 凌 何玉清 马晓梅 张 蓉

单纯疱疹病毒性角膜炎（herpes simplex keratitis，HSK） 主要是由Ⅰ型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus typeⅠ，HSV-Ⅰ） 感染后在角膜引起的免疫病理性疾病〔1〕，由于其反复发作、病程迁延的特点，最终造成角膜混浊以致失明。目前尚无确切有效的药物可以防止单纯疱疹病毒性角膜炎复发。 亢泽峰〔2〕等曾对益气解毒中药抗HSK 复发进行了临床研究，结果表明：益气解毒中药能够显著延长患者复发时间，缩短每次持续时间，具有良好的抗复发效应。 为进一步了解该药抗HSK 复发的免疫学机理，我们对该药治疗前后患者的外周血T 淋巴细胞及其分泌的细胞因子进行观察与比较。 现报道如下。

1 资料和方法

1.1 临床资料

收集复发性HSK 患者160 例（青海省人民医院眼科门诊、住院患者)，其中男88 例，女72 例，平均年龄（40.28±9.56）岁，复发次数最少2 次，最多10次。两组在平均年龄、复发次数及持续时间上均有可比性（P＞0.05）。

1.2 诊断标准与分型〔2〕

1.2.1 诊断标准：①有感冒、发热或特定的发病诱因，反复发作。②角膜知觉减退，结膜充血。③角膜混浊，呈树枝状、地图状或盘状改变。④荧光素角膜染色阳性。

1.2.2 分型：纳入研究的患者分为：上皮型角膜炎；非坏死性角膜基质炎；树枝状角膜溃疡。

1.2.3 纳入标准〔1〕：①年龄在16～65 岁的患者，男女不限；②符合HSK 诊断标准；③HSK 活动期患者在进入研究前至少复发2 次以上者； ④患有复发性HSK 并经两名研究者独立诊断的患者。

1.2.4 排除标准〔3〕：排除坏死性基质型角膜炎、细菌性角膜炎、真菌性角膜炎等其他感染性角膜炎等。

1.2.5 复发标准：出现畏光、流泪、眼痛，角膜上皮缺损呈点状、树枝状或地图状，或角膜基质水肿、混浊，角膜荧光素染色阳性，角膜知觉减退等。排除细菌性角膜炎、真菌性角膜炎等其它感染性角膜炎，即诊断为HSK 复发。

1.3 方法

1.3.1 所有患者在急性期观察临床总有效率和平均住院日，治疗有效者继续原治疗达到临床治愈，并对患者随访1 年，观察复发情况（失访率＜20%），3 例无效患者进行住院或转院治疗。

1.3.2 主要试剂：r-INF、IL-18 检测试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司）；0.15%更昔洛韦眼用凝胶(湖北科益药业有限公司)；黄芪桂枝口服液(青海省人民医院院内制剂，批号：青制字：2000 第Z-0286）。

1.3.3 给药方法：治疗组：生黄芪，炒白术，防风，桂枝，蒲公英，金银花，密蒙花，蝉蜕，决明子，生姜2片，红枣1 枚，每日1 剂，水煎服，分2 次服用，14 天为1 个疗程。共服药2 个疗程；同时给予0.15%更昔洛韦眼用凝胶点眼，每日3 次。有基质水肿时给予妥布霉素地塞米松滴眼液（ALCON）点眼，每日4 次。伴房水闪辉时给予复方托吡卡胺散瞳。 用药前后监测肝肾功能，未出现不良反应。 对照组：0.15%更昔洛韦眼用凝胶点眼，每日3 次，有基质水肿时给予妥布霉素地塞米松滴眼液点眼，每日4 次。 伴房水闪辉时给予复方托吡卡胺散瞳。

1.4 T 淋巴细胞亚群检测过程：青海省人民医院检验科完成。

两组患者均在治疗前后抽取外周静脉血约3 ml，加肝素（20 μ/ml）抗凝，用淋巴细胞分离液制备淋巴细胞悬液，采用间接免疫荧光染色后再用流式细胞仪检测T 细胞亚群。 取已制备的淋巴悬液各100 ml，分别加入100 μl 抗CD3、CD4、CD8（鼠抗人）单克隆抗体（Murine Monoclonal Antibody）。 混匀、避光、室温孵育30 min，加入l ∶200 稀释的二抗(羊抗鼠Ig-FITC）100 μl 室温孵育30 min，最后加PBS 液2 ml 上机检测。 实验中用PBS 液分别代替一抗、二抗作阴性对照。 每份样本检测10 000 个经细胞计数荧光标记阳性的细胞。 采用流式细胞仪检测所有患者治疗前后外周血T 淋巴细胞亚群比例。

1.5 细胞因子（IL-18、IFN-γ）检测过程（青海省人民医院检验科完成）

1.5.1 标本的采集：选用EDTA 作为抗凝剂，标本采集后将标本放于-20 ℃或-80 ℃保存，进行实验时提前30 分钟取出标本，置于2～8 ℃自然解冻，1 000 r/min，离心15 分钟，但应避免反复冻融。

1.5.2 操作步骤：实验开始前，提前配置好所有试剂，混匀时尽量避免起泡。 设置好0.01 pg/ml，50 pg/ml，100 pg/ml，250 pg/ml，500 pg/ml，1 000 pg/ml 六个标准品；①加样；②甩干；③温育60 min 后，弃去孔内液体，甩干，洗板3 次；④每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液）100 μl，37 ℃，温育60 分钟；⑤弃去孔内液体，甩干，洗板5次。 ⑥显色；⑦依序终止反应；⑧测光密度（OD 值）。

1.6 统计学方法：所有数据均采用SPSS 17.0 统计学软件进行分析处理；计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间均数比较采用独立样本t 检验，配对资料采用配对t 检验，以α=0.05 为检验水准进行统计学分析。

2 结果

2.1 两组临床疗效比较（表1～2）

失访14 例，失访率＜20%。 失访原因：青海幅员辽阔，部分患者家住偏远地区，交通不便，痊愈后未能复查并且没有电话。

表1 两组HSK 患者1 年内复发情况比较（眼数/只，%）

表2 HSK 治愈患者第1 次复发平均时间（天）比较（眼数/只，x±s）

表3 两组HSK 治愈患者治疗前后1 年内复发频次比较（眼数/只，x±s）

2.2 治疗前、后T 淋巴细胞亚群检测结果

表4 HSK 患者治疗组与对照组治疗前后CD3、CD4 及CD8 比较（x±s）

由表1～3 可看出，黄芪桂枝口服液可明显降低患者的复发率、缩短患者每次复发的平均天数。 从表4 可见：治疗组治疗前、后相比T 淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD4/CD8 升高，CD8 下降（P＜0.05）；对照组：治疗前后相比CD3、CD4、CD4/CD8 淋巴细胞无明显变化，CD8 降低，差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 治疗前后黄芪桂枝口服液对T 细胞分泌的细胞因子的影响

表5 黄芪桂枝口服液治疗前后细胞因子比较（x±s）

3 讨论

根据中医“久病致虚，虚易受邪”理论，结合HSK的发病特点，我们认为HSK 反复发作的主要病因是伏邪内伤，新感即发，病机特点为气虚邪留，邪毒内伏，关键环节为“虚”、“毒”，是在邪侵正虚的基础上，演变为正虚邪恋的互患之势，以其病、证结合病位，进行辨证论治，以“扶正祛邪”为治则、“益气托毒”为治法遣方用药。 方中黄芪、炒白术健脾益气、托毒外出补后天；合防风固卫表而御外邪；入桂枝调和营卫，助阳制寒；银花、紫草、蒲公英增清解之力，重在托毒祛邪，以达“正气存内，邪不可干”之效。

目前治疗HSK 最常用的药物是阿昔洛韦、更昔洛韦、细胞因子、手术治疗与基因疫苗学治疗。 多年来的临床和实验研究均表明，机体免疫功能低下是诱使病毒活化、产生复发的重要原因〔6，7〕，单纯采用抗病毒药物治疗，虽然能起到抑制病毒复制、控制当时发作的作用，但因不能彻底清除残留在眼部或潜伏在三叉神经节内的病毒，一旦遇到过劳、感冒等机体免疫功能低下或应用皮质类固醇药物等情况时仍可复发。 因此抗复发不仅要抑制潜伏在三叉神经节内HSV-1 再活化，更要重视提高机体的免疫功能，增强自身抗病毒及清除病毒能力，而益气扶正中药有明显的免疫调节作用〔8，9〕。

大多数研究结果表明〔10〕：HSK 复发的主要免疫介质是CD4+T 淋巴细胞及其分泌的相关因子。 Th1所产生的IFN-γ 和IL-18 等细胞因子主宰细胞免疫〔11〕。 IL-18 是一种炎性细胞因子，能够诱导IFN-γ的产生〔12〕，参与了多种炎性反应性疾病和自身免疫性疾病的发生、发展和转归，在免疫反应过程中它促进Th1细胞的活性并促进Th1细胞合成和分泌IFNγ〔13〕。 IFN-γ 是由Th1型细胞分泌的，具有广谱抗病毒活性，通过人体免疫细胞的细胞酶效应,诱发出多种抗病毒蛋白,调节机体的免疫功能抑制病毒复制与繁殖。有研究结果表明：IFN-γ 在角膜感染的免疫应答全过程中均有表达〔14〕，这有助于抵御HSK 的复发感染。 本研究通过观察治疗前后T 淋巴细胞的变化及其分泌的细胞因子IFN-γ、IL-18 的变化来阐明黄芪桂枝口服液抗HSK 复发的作用机理。

本研究结果表明：黄芪桂枝口服液可以通过调节机体的免疫力来起作用，主要是通过激活CD4+淋巴细胞的活性，促进体内IL-18 的分泌，诱导抗病毒因子IFN-γ 的产生来促进CD+TH1细胞的免疫应答、提高机体的免疫功能、非特异性的阻抑眼部潜伏的HSV-1 再活化，从而降低HSK 的复发。

黄芪桂枝口服液之所以有较好的抗复发作用，就在于本方具有清热解毒以祛邪治标，益气固表以扶本护目，祛邪与扶正同施，标本兼治的作用，充分体现了中医药“祛邪扶正”防治HSK 复发的基本学术观点。 在本次研究中我们发现该药对角膜上皮炎治疗效果明显，而角膜溃疡后期会出现神经营养性角膜上皮病变，推测本方对此可能也有一定的治疗作用，这将在今后的实验中进行。在进行免疫学研究时未能将浅层型与深层性角膜病变分别研究并且对照分析，针对存在的这些问题，我们将会在今后的研究中予以注意并加以区分。

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