解毒化瘀方逆转HL60/VCR白血病细胞耐药株多药耐药机制研究

刘 思，姚宇红（指导）

（1.贵阳中医学院2010级硕士研究生，贵州 贵阳 550002；2.贵阳中医学院第二附属医院血液内科，贵州 贵阳 550003）

解毒化瘀方逆转HL60/VCR白血病细胞耐药株多药耐药机制研究

刘 思1，姚宇红（指导）2

（1.贵阳中医学院2010级硕士研究生，贵州 贵阳 550002；2.贵阳中医学院第二附属医院血液内科，贵州 贵阳 550003）

目的：探讨解毒化瘀方对HL60/VCR白血病细胞耐药株多药耐药逆转机制。方法：通过制备含解毒化瘀药的兔血清培养HL60/VCR白血病细胞耐药株后，用免疫组化法检测细胞的多药耐药基因P-gp。结果：解毒化瘀方含药血清能下调HL60/VCR白血病细胞耐药株的P-gp表达。结论：解毒化瘀方逆转HL60/VCR白血病细胞耐药株多药耐药与其能下调P-gp的表达有关。

解毒化瘀化方；逆转；多药耐药；P-gp

目前白血病治疗中最棘手的问题是长期化疗药物导致的多药耐药现象，我们采用解毒化瘀方逆转多药耐药机制有一定效果，总结如下。

1 材 料

解毒化瘀方水煎剂的制备：将解毒化瘀方（青黛10g、川芎10g、莪术15g、山慈姑15g、丹参20g、虎杖20g、重楼30g、补骨脂30g）的饮片放于煎煮容器内，加1～2L冷水浸泡30min，煮沸后文火煎熬，直至药物浓度为1g/mL，再将药液过滤出来，弃去药渣。

含药血清的制备：将18只新西兰大白兔（购于贵阳医学院动物实验中心）随机分为3个不同剂量组，各组分别按低剂量组3g生药/kg体质量、中剂量组6g生药/kg体质量、高剂量组12g生药/kg体质量，灌服中药液，每日1次，连续3天。于末次给药后2h无菌条件下心脏取血，分离血清，组内血清混合，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置-20℃保存备用。

正常兔血清的制备：灌药前1天取兔血，分离血清，方法同前。

试剂及仪器：RPMI-1640培养基（sigma公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），MTT试剂盒（凯基生物），P-gp试剂盒（北京博奥森生物）。超净工作台（中国苏州），CO2培养箱（美国NAPCO），通用酶标仪（BIO-TEX美国），倒置显微镜（日本尼康TS100-F）。

2 方 法

2.1 细胞的培养

HL60细胞的培养：HL60细胞接种于含5%胎牛血清的RPMI1640培养液，在37℃、5%CO2条件下培养，取对数生长期细胞，2～3天传代1次，更换细胞液。

HL60/VCR细胞的培养：HL60/VCR细胞接种于含5%胎牛血清的RPMI1640培养液，并加10μg/mL的VCR维持，在37℃、5%CO2条件下培养，取对数生长期细胞，2～3天传代1次，更换细胞液。

2.2 细胞的检测

MTT检测细胞毒作用：取1×105对数生长期白血病HL60和HL60/VCR细胞株细胞，用含5%胎牛血清的RPMI1640培养液配成细胞悬液，每孔180μL，加至96孔培养板中，每组设3个平行孔，分3个剂量VCR组，加入不同浓度VCR后，细胞在培养板中适应生长12h，分别加入实验药物各20μL，使每孔终体积为200μL；每一板次测定，均设一列全空白对照组，不加细胞和药物，同样作其它处理，光密度扫描时，以该列光密度值作本底，校正其它测量值。在37℃，5%CO2浓度，饱和湿度条件下的培养箱内培养72h，每孔加入5mg/mL的MTT液20μL，相同条件下培养4h，离心去上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150μL，微量振荡器振荡10min，充分溶解药物，于自动酶标仪检测各标本吸光度（OD）值，计算耐药倍数。

免疫组化方法检测P-gp表达：采用免疫酶标组化方法，将细胞悬液1×109/L加入24孔板中，每孔1mL。其中12孔再加入含药血清，37℃、5%CO2孵育2h，细胞涂片，依次加入一抗、二抗、三抗，坚固红显色及苏木素复染，普通显微镜观察，阳性结果为玖瑰红色。

2.3 统计学处理

3 结 果

MTT细胞毒作用：在HL60、HL60/VCR细胞培养液中分别加入浓度梯度VCR，培养72h后，VCR对两种细胞是产生了不同的抑制作用，根据自动酶标仪检测HL60细胞IC50浓度OD值为33.127，HL60/VCR细胞IC50浓度OD值为149.001，求得HL60/VCR细胞耐药倍数为4.5倍。

解毒化瘀药对HL60/VCR细胞P-gp表达水平的影响：经免疫组化染色后，可见未加药HL60/ VCR细胞被染成玫瑰红色，经含药血清处理后的HL60/VCR细胞，染色降低，与未加药的HL60/ VCR细胞比较有显著差异，中药血清联合干扰素组亦可见染色明显降低，研究显示P-gp在HL60/ VCR细胞中成高表达，HL60细胞成低表达，加用解毒化瘀方含药血清处理后，高中低剂量组和干扰素组能够明显降低P-gp在HL60/VCR细胞中的表达，而空白对照组和兔血清组对表达无影响。

4 讨 论

中医对白血病多药耐药逆转机制的研究也取得了一定的进展，田亮等［1］研究发现藤黄酸能通过下调Survivin及P-gp蛋白的表达，增强耐药细胞对治疗药物的敏感性，从而逆转白血病K562/A02细胞的耐药作用。解毒化瘀方对白血病细胞多药耐药机制也有一定的逆转作用，中医认为白血病主要是因为温热毒邪的入侵，其耐药主要是由于毒邪留恋，扰乱血络，导致毒瘀互结，病情顽缠，反复发作［2］。解毒化瘀方中青黛清热解毒、凉血消肿，含有靛玉红对细胞内的周期依赖性蛋白激酶有抑制作用，致癌细胞的细胞周期停滞，从而抑制肿瘤细胞增殖［3］。山慈姑清热解毒、消肿散结，含秋水仙碱，能抑制细胞的有丝分裂，对多种癌细胞有杀灭作用［4］。重楼清热解毒、消肿止痛，鄢圣英等［5］研究发现重楼复方水煎剂能使癌组织坏死，并且与药物的浓度呈正相关性。虎杖、莪术、川芎、丹参活血、行血、散血、凉血。补骨脂补肾助阳，其内含有补骨脂素为钙离子通道拮抗剂，蔡宇等［6］研究发现补骨脂素能够通过调节细胞内Ca2+浓度逆转HL60/HT耐药细胞的耐药。白血病细胞耐药株HL60/VCR进行含解毒化瘀药的兔血清培养后，再进行涂片染色，其细胞的着色并不是很好明显的玫瑰红色，说明细胞中P-gp的含量并不高。而没有加用含药血清的细胞组中的细胞染色比较明显，呈现很明亮的玫瑰红色，说明原耐药细胞上的P-gp表达很高。通过两组的对比发现，解毒化瘀药含药血清能够降低细胞上的P-gp蛋白，证明解毒化瘀方能够逆细胞药株耐药的机制是降低细胞上的P-gp表达。含解毒化瘀药血清组又分高中低3个组，在分别进行染色后发现着色深浅不同，含高剂量药物的血清组明显比含中剂量药物的血清组的着色浅，而含中剂量药物的血清组又明显比含低剂量药物的血清组的着色浅，说明不同的药物浓度对P-gp的表达影响不同，其中浓度高的下调P-gp的能力要比浓度低的强，即药物下调细胞上的P-gp的强度与药物浓度呈正相关性，证实解毒化瘀药逆转细胞耐药的机制与其能够下调P-gp有关，并且这种关系是正相关性。马武开等［7］在对白血病HL60/ADR细胞Mdr1、NF-JB的表达及解毒化瘀药的干预作用的研究中也发现含解毒化瘀药浓度越高的血清作用效果越明显。另外，在药物的对照组中还有西药干扰素对照，虽然干扰素对耐药细胞也有逆转作用，但用干扰素与含药血清合用后效果更为明显，细胞呈现的颜色更浅，证实了含药血清对耐药细胞的逆转作用。

［1］田亮，刘娟，陈宝安，等．藤黄酸对白血病K562/A02细胞的耐药逆转作用［J］．中国实验血液学杂志，2012，20（2）：252-257．

［2］马武开．难治性白血病从毒论［J］．中国医药学报，2004，19（4）：241．

［3］刘雅波，陶文沂．18种青黛7-氮杂靛玉红对6种肿瘤细胞增殖的影响［J］．天然产物研究与开发，2010，22（5）：899-906．

［4］厉秀云，李振民．疏肝健胃清热解毒法治疗胃癌前病变65例［J］．陕西中医杂志，2009，30（1）：7-8．

［5］鄢圣英，余建平，袁珂，等．蚤休复方水煎剂抗癌作用及对肝肾毒副作用的研究［J］．中药材，2008，31（12）：1855-1857．

［6］蔡宇，余绍蕾，徐炎，等．补骨脂素对HL60/HT耐药细胞逆转及对细胞内Ca2+浓度影响研究［J］．中国药学杂志，2006，41（12）：905-907．

［7］马武开，李玉莹，姚血明，等．白血病HL60/ADR细胞Mdrl、NF-κB的表达及解毒化瘀药的干预作用［J］．西安交通大学学报（医学版），2011，32（5）：592-595．

Objective：To study the reversion of MDR mechanism of Detoxification and Dissipation Blood Stasis Formula on HL60/VCR leukemic cell drug resistance strains.Method：HL60/VCR leukemic cell drug resistance strains were cultured with rabbit serum containing Detoxification and Dissipation Blood Stasis Formula，then the MDR gene P-gp was detected by immunohistochemistry method.Result：The serum containing Detoxification and Dissipation Blood Stasis Formula could down-regulate the expression of P-gp of HL60/VCR leukemic cell drug resistance strains.Conclusion：The reversion of MDR of Detoxification and Dissipation Blood Stasis Formula on HL60/VCR leukemic cell drug resistance strains is related to that it could down-regulate the expression of P-gp.

Detoxification and Dissipation Blood Stasis Formula；reversion；MDR；P-gp

R255.737

B

1004-2814(2013)04-241-02

2013-01-31