中药质量控制与评价方法研究概况

2013-04-08刘亚明李晓刚

实用中医药杂志 2013年4期

关键词：药典指纹图谱

刘亚明，李晓刚，彭青

（重庆市合川区中医院药剂科，重庆 401520）

中药质量控制与评价方法研究概况

刘亚明，李晓刚，彭青

（重庆市合川区中医院药剂科，重庆 401520）

近年来，中药以其独特的疗效越来越受到世界各国的青睐和重视［1］，但是由于中药的复杂性、技术条件、研究思路和方法等因素的局限［2］，使中药质量评价成为制约中药现代化与产业化的“瓶颈”［3］。

中药质量的评价和质量控制是保证中药安全性和有效性的重要手段，在中药研究、生产及临床应用过程中具有重要作用［4］。现就中药质量标准以中药质量控制的研究进展综述如下。

1 中药质量标准研究

近年来，由于化学、现代生命科学、分析科学技术的大量使用和科技的进步，许多新试验技术方法和现代化分析仪器不断运用于鉴定中药质量标准［5］，使得中药质量标准水平有了很大提高［6］。

在我国，中药质量标准的建立从无到有，经历了长期的过程。纵观中国药典的发展概况，我国药典迄今已出版9部，按照发展水平大致可以分为3个阶段。1953年版和1963年版的《中华人民共和国药典》为第1个阶段，这两部药典只收载了药材的性状鉴别，还处于外观形态的经验鉴别水平，无专属性鉴别，缺乏定量指标，是我国中医药工作者长期积累的丰富经验的总结。1963年版药典的附录中第1次对紫外分析法进行了简单的描述，可见当时已孕育了仪器分析的萌芽。1977年版《中华人民共和国药典》为第2个阶段，药典在经验鉴别的基础上大量收载了显微鉴别以及部分的化学试管反应，比之前单纯以外观形态的经验鉴别有了明显提高，同时对经典色谱法进行了介绍。1985至2010年的6部《中华人民共和国药典》可以看作是第3个阶段，现代分析仪器和检测方法在这一阶段得到大量的使用，中药及其制剂的质量评价也更为全面。1990年版《中华人民共和国药典》首次使用现代仪器检测方法，如HPLC、GC及TLCS测定中药活性成分或指标成分的含量。1995年版药典中，现代分析仪器的检测方法使用率和使用次数明显增加。2000年版《中华人民共和国药典》中，首次在附录中引入火焰光度法和毛细管电泳法。2005年版《中华人民共和国药典》（一部）附录中主要收载的现代化分析仪器主要有分光光度法、色谱法和质谱法。2010年版《中华人民共和国药典》（一部）附录在2005年版药典的基础上新增离子色谱法、核磁共振波谱法、拉曼光谱法指导原则等现代仪器分析技术，中药品种中新增了液相色谱-质谱联用、DNA分子鉴定、薄层-生物自显影技术等方法。

2 中药质量控制方法

中药多元的活性与独特的疗效是其较为复杂成分共同作用的结果。现行的中药质量控制模式是借鉴国外化学药品质量控制模式建立的。化学药品具有明确的分子结构，清晰的构效关系，因此鉴别、检查、含量测定都可以直接作为质量评价的指标，但是对于在中医理论指导下的中药，尤其是复方制剂，检测其中任何一种成分均不能体现其整体质量。因此，需要重新审视和明确中药质量控制和评价的目标、策略、模式与方法，建立一套既能保证稳定可控，又能直接关切安全有效的新型中药质量控制管理方法体系。

2.1 中药指纹图谱技术

指纹图谱技术是近年发展起来的一种中药质控手段［7］，通过测定药材中各色谱峰的峰面积或峰高比值来确定样品中化学成分的相对含量，并结合数理统计方法，通过样品间相似度的比较来评价中药材及其制剂质量的优劣。能比较全面地反映中药中所含化学成分的种类与数量，在现阶段有效成分大多没有明确的情况下，能比较全面的反映中药内在质量［8］。按照应用对象进行分类，中药指纹图谱可以分为中药材指纹图谱、中药原料指纹图谱、中间产品指纹图谱、中药制剂指纹图谱等。根据测定时所采用的分析手段不同，中药指纹图谱可分为中药生物指纹图谱和中药化学指纹图谱。

建立指纹图谱的方法。首先收集中成药样品、原料药材及中间半成品等，作为研究对象。每个研究对象至少要10批［9］，其次采用化学方法对研究对象进行预处理，针对不同的研究成分选用不同极性的试剂进行提取、分离，得到不同极性成分的试样，之后采用色谱法、波谱法等方法对试样进行分析，得到样品的指纹图谱，运用计算机图谱解析技术对指纹图谱进行解析和处理，获得指纹特征，以此为基础检测样品质量的稳定性等其他工作。①色谱法：色谱指纹图谱主要包括薄层色谱（TLC）、高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）、高速逆流色谱（HSCCC）及毛细管电泳（CE）指纹图谱等。色谱技术具有分离效能强、能够与多种检测器联用的特点，能够在实现色谱分离的同时分析得到的各种波谱信息，以实现物质的定性定量。因此，色谱技术已成为获取中药指纹图谱的主要手段之一。米莉莉等［10］对不同虫草样品建立荧光淬灭薄层色谱指纹图谱，得到的荧光淬灭薄层色谱指纹图谱，能为人工虫草和天然虫草提供直接的指纹鉴别，方法快速简便、重现性好。Rana Ajay等［11］使用C12反相色谱柱，采用一种快速、简便、灵敏的HPLC-DAD法对茶黄素进行了分析与含量测定。Aviv Amirav等［12］采用一种新型的气相色谱-质谱联用技术半在线地监控反应的最佳化回收率、阐明其反应机理，并且获得反应产物特性及纯度。Gu Ming等［13］采用高速逆流色谱法（HSCCC）分析丹参药材中12种成分并获取指纹图谱，根据其相对保留时间、相对峰面积、相对保留时间的相对标准偏差值、相对峰面积的相对标准偏差值、差异率及特征指纹图谱建立数字化色谱，结果表明高速逆流色谱-数字化指纹图谱（HSCCC-DCFS）是一种能够定量、直观的获取丹参药材指纹图谱的方法。②波谱法：波谱法主要包括紫外（UV）、红外（IR）、核磁共振（NMR）、质谱（MS）等方法。由于UV、IR反映的是化合物的结构信息，结果具有加和性，很难表述中药材或中成药这样复杂体系中各成分浓度分布的整体状况。但是如果借助于计算机分类技术或模糊数学方法对信息进行处理，还是可以用于鉴别不同药材的。目前NMR一般用1H-NMR，其图谱具有专属性、全面性、定量性、易辨性等特点，且具有信息量大、可重复性好的优点，主要用于鉴别植物类药材的真伪优劣。Minghua Yang等［14］采用一种定量质子核磁共振技术（qHNMR）成功对常用中药穿心莲中的穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯及新穿心莲内酯进行定量分析。 ③X射线衍射法：X射线衍射法的原理是当某一物质受到X射线照射会产生不同程度的衍射现象。该物质产生特有的衍射图谱反映了物质的组成、晶型、分子内成键方式及分子的构型等特征。王丽娟等［15］用粉末X射线衍射技术建立了麋鹿角X射线衍射Fourier指纹图谱分析方法，并与鹿角进行指纹图谱比较分析，为麋鹿角的开发利用、药材品质评价提供了依据与方法。Wang S等［16］采用粉末X射线衍射傅里叶指纹图谱模式获得五批当归药材的特征性衍射峰，以此对当归药材进行鉴定。 ④分子生物学法：理论基础是基因的多态性，而基因多态性可在分子水平上进行检测，检测方法包括电泳技术、免疫技术和DNA分子遗传标志技术［17］。

随着《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》（暂行）的出台，指纹图谱技术将在中药质量控制中发挥更加重要的作用，但该方法目前还存在不少缺点。一是中药化学指纹图谱只是中药部分成分的“化学条形码”，不能全面控制所有成分，有相当一部分中药化学成分难以用常规的色谱或光谱方法检识，如多肽、多糖类等；二是虽然中药化学指纹图谱在保证产品质量一致性和稳定性方面有促进作用，但难以反映其安全性有和有效性；三是受到操作、仪器的影响，中药化学指纹图谱的重复性、专属性和代表性等仍需要深入研究。

2.2 化学计量学方法

化学计量学（Chemometrics）自上世纪70年代初诞生起，在施行化学量测的各个领域中得到了迅速的发展和完善［18］。国际化学计量学学会（International Chemometrics Society，ICS）给化学计量学作出了如下的定义为“化学计量学是一门通过统计学或数学方法将对化学体系的测量值与体系的状态之间建立联系的学科”［19］。化学计量学的最大特征是将多变量分析方法引入化学研究，从这些特点分析，化学计量学方法与中药复方整体研究相结合能够发挥重要的作用。如果说中药复方的现代化整体研究可以被称为“信息输出者”，将化学计量学引入数据分析的过程，建立一套系统的研究模式，则必将成为一种有效的“问题解决者”。

主成分分析法（principal component analysis，PCA）：PCA是对多变量数据进行统计处理的一种线性投影判别方法，是在不明显减少有用信息的前提下，将高维空间压缩到低维空间［20］，通过对原特征（经标准化后的）变量进行线性组合，形成若干个新的特征矢量，要求它们之间相互正交，并能最大限度地保留原样本集所含的原始信息，这些矢量即称为主成分［21］。张兴辉等［22］应用主成分分析法（PCA）对来源于全国不同产地的女贞子进行了化学模式识别研究，结果显示不同产地的女贞子化学成分的差异较大，炮制后也对成分有较大影响，表明PCA分析法化学模式识别研究可用于女贞子的质量评价。

聚类分析法：聚类分析的目标是在模式空间中找到客观存在的类别，“物以类聚”是聚类分析的基本出发点。该法不但用于中药品种的鉴别，还用于中药真伪的鉴别、成分分析、质量优劣的评价、新旧工艺的比较等方面［23］。戴荣华等［24］采用高效液相色谱法对中药牛膝进行了分析测定，将所获得的化学数据用于化学模式识别研究，用系统聚类分析对牛膝的真伪和质量优劣进行判别，再根据判别结果采用逐步判别分析进行回判，正确率达100%，表明聚类分析法能够运用于中药的质量优劣划分。

判别分析法：判别分析是类别明确的一种分类技术，其根据观测到的某些指标对所研究的对象进行分类。在中药质量控制实验中，判别分析是指在已知研究对象分成若干类型并取得各种类型的一批已知样品的观测数据，在此基础上建立判别式，然后对未知类型的样品进行判别分类［25］。王艳华等［26］用系统聚类分析将半夏样品分为生品和炮制品两类，用逐步判别分析对样品的鉴定和质量分级结果进行回判，正确率达100%。初步建立了只通过HPLC分析即可对半夏进行质量评价的模型。

人工神经网络（artificial neural network，ANN）：ANN又称神经网络，起源于本世纪40年代，是由大量的、同时也是简单的处理单元广泛连接构成的复杂网络系统，反映了人脑的基本功能，是对人脑所作的某种简化、抽象和模拟。张亮等［27］运用人工神经网络和非线性映射技术对戊己丸进行了省缺药材的定性识别研究，实验数据为药材浸出物的红外光谱，结果表明人工神经网络能对多种情况进行识别，正确识别率为85%，明显优于非线性映射技术。

模糊数学与灰色系统理论：模糊数学主要是为解决自然界及人类思维中普遍存在的模糊性现象而提出和建立的。而模糊技术则是在模糊数学理论基础上发展起来的一种高新技术，即是模糊数学与计算机、信息、自动控制技术相结合的产物［28］。苏薇薇等［29］采用模糊数学方法处理黄芩的微量元素数据，对10个不同产地的黄芩样品进行了分类，获得满意结果。

2.3 “一测多评”法

中药多成分、多功效的作用特点决定了单一成分难以表达中药的质量，多成分同步质量控制模式应运而生并得到了迅速普及。而现实中对照品供需矛盾和多指标质控高昂的检测成本反过来又限制了多指标质量控制模式在实际生产、科研中的应用。那么，是否能够找到一种方法既能实现多成分的质量控制又能克服对照品紧缺和检测成本高的困难［30］。并且根据中药有效成分间存在的内在函数关系和比例关系，通过测定1个成分（对照品可以得到者）来实现多个成分（对照品没有或难以供应）的同步监控，这是“内标校正法”或者“一测多评法”的基本设计思想［31］。黄山君等［32］等采用HPLC和UPLC法，以芍药苷为内标物，建立其与芍药内酯苷的相对校正因子，并进行含量测定，实现一测多评，同时采用外标法测定16批白芍中芍药苷、芍药内酯苷的含量，验证“一测多评法”的准确性。

3 小结

中药能够发挥多元的临床药效是其复杂的多组分物质基础在代谢过程中以多靶点、多层次作用的综合结果，客观上也造成中药质量控制技术与方法难以满足现实的需要。长期以来，中药质量控制是以化学成分为核心进行建立的，从单一成分向多成分的过渡，虽然是一种进步，但是仍未能全面、综合的反映中药内在质量。指纹图谱虽然能较全面的反映中药的化学成分，但是在众多的指纹峰中，哪些是有效成分、哪些是可以舍去的成分，仍然是一道难题。因此，应继续以中药色谱指纹图谱为核心，并结合对中药化学成分、中药药理作用的研究，以期揭示中药起效所对应的物质基础，进而对中药质量进行综合、全面的评价。

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