Toll样受体及其在尿路感染发病中的作用研究进展

黄 红，那 宇

(1 安徽医科大学解放军306临床医院，北京 100101;2 中国人民解放军306医院)

目前，泌尿系统的获得性免疫已经获得广泛研究，而固有免疫的研究虽已开展120多年，研究的方向却很局限。既往研究大多数局限在皮肤或黏膜的屏障作用、体液的杀菌作用、单核巨噬细胞及粒细胞的吞噬作用、自然杀伤(NK)细胞的杀伤作用、炎性因子的炎症作用等方面。随着20世纪90年代模式识别受体(PRR)概念的提出，特别是Toll样受体(Toll-Like Receptors，TLRs)的发现，泌尿系统的固有免疫研究进入一个崭新的阶段。现将TLRs及其在尿路感染发病中作用的研究进展综述如下。

1 TLRs在泌尿系统的分布

目前已发现，哺乳动物中的TLRs至少有13种，其中在人体表达的TLRs为TLR1～TLR10。整个尿路包括尿道、膀胱、输尿管中均有多种TLRs的分布。Pudney等［1］对正常男性和HIV阳性患者生殖系统进行的研究发现，男性尿道海绵部的白细胞内有TLR2、TLR3、TLR5、TLR7 和 TLR9 表达，并且是生殖系统中表达TLRs最多的部位，前列腺上皮细胞内也有各种 TLRs的表达。Ayari等［2］通过反转录方法发现，正常人膀胱上皮细胞可表达 TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7 和 TLR9。徐华超等［3］从肾全切除术的肾肿瘤患者肾脏组织中分离肾小管、肾盂、输尿管和膀胱上皮，进行原代培养和细胞鉴定，也发现上述组织均有TLR2和TLR4的表达。

目前泌尿系统中研究最多的三种TLRs是TLR4、TLR5和TLR11。TLR4在膀胱和肾脏均有表达，TLR5主要在膀胱表达，TLR11主要在肾脏表达［4］。以TLR4在膀胱炎中的固有免疫研究最为深入。TLR11主要在小鼠肾脏表达，缺乏TLR11的小鼠肾脏表现出对致肾盂肾炎细菌的高度易感性。人类缺乏 TLR11的表达，虽然实验证明人体存在TLR11的短缩形式 ，但呈失活状态，此可能为人体易发生泌尿系感染的重要原因［5］。

2 TLRs识别的配体

TLRs属于I型跨膜蛋白，其胞内区与IL-1受体的胞内区相似，称为TIR(Toll/IL-1 receptor homologous region)，负责受体活化后的信号转导，而胞外区结构有富含亮氨酸的重复序列，负责识别不同的病原分子。针对不同的病原体，TLRs可识别不同生物上的病原体相关分子模式(PAMPs)，每一类TLR单独或与辅助因子结合可识别一种或几种PAMPs。

TLR1可识别三酰基脂肽、可溶性因子。TLR2主要识别G+细菌的肽聚糖、脂蛋白和脂磷酸壁，亦可识别G-细菌的脂蛋白、支原体和螺旋体、真菌或膜孔蛋白的酵母聚糖、肾脏钩端螺旋体等。TLR4主要识别G-细菌细胞壁的脂多糖(LPS)成分。除LPS外，TLR4还可识别磷壁酸、呼吸道合胞病毒F蛋白等配体。TLR5可识别细菌的鞭毛，鞭毛素D295和D367区域是细菌鞭毛的主要组成部分，可与TLR5在细胞表面结合。TLR6可识别支原体的二酰基脂蛋白、G+细菌的胞壁酸、真菌的酵母多糖等。TLR9可识别未甲基化CpG-DNA。TLR11可识别尿路致病性大肠杆菌(UPEC)，其配体目前还不清楚，且不存在于非致病性大肠埃希菌和G+细菌中。此外还有TLR3、TLR7、TLR9，被认为是最主要的识别病毒核酸的模式识别受体［6］。最近研究表明，TLRs还可识别某些内源性配体，如 TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6 可识别热休克蛋白、坏死的小管细胞及细胞外基质成分等［7］。

细菌、真菌、支原体、衣原体、病毒、寄生虫等均能引起尿路感染。因为95%以上的尿路感染是G-细菌感染，故TLR4在尿路感染者固有免疫中的作用最显著。TLR11因配体尚不清楚，成为目前研究的重点。2005年Yarovinsky等［8］对鼠弓形虫的研究证实，弓形虫内的一种Profiling样蛋白可通过与TLR11结合激活树突状细胞(DC)，启动骨髓分化蛋白88(MyD88)依赖性信号通路，首次从化学上定义了TLR11的配体。近年研究发现，日本血吸虫成虫体内存在与鼠弓形虫中的Profiling样蛋白有相似结构域的一种蛋白，血吸虫成虫体内能否找到与TLR11结合的配体成为今后的一个研究方向。此外，TLR11与TLR5具有相似的多态现象，人尿道细菌菌毛上是否存在一种鞭毛样蛋白能与TLR11结合亦为今后研究的焦点。目前关于TLRs在G-细菌感染中的研究已经很多，在其他病原体感染中所扮演的角色也越来越受到关注［9］。

3 TLRs信号转导途径

3.1 经典途径 即MyD88-NF-κB途径。所有的TLRs均可启动MyD88依赖途径，且在尿路各段发生炎症时都可启动。此途径有四类接头蛋白:MyD88、包含TIR的接头蛋白、包含TIR的接头分子1(TICAM-1)、TICAM-2。其中MyD88是TLR信号转导中最重要的连接蛋白，位于胞内，是TIR的接头蛋白，由一个N端死亡域(DD)和一个 C端 TIR(Toll/IL-1R)域组成。配基与TLR胞外段结合，使之二聚化并与MyD88的Toll结构域结合，同时诱导MyD88的DD活化，MyD88通过DD募集含有DD结构域的信号分子并使信号向下传导，可激活NF-κB。NF-κB活化后游离释放并转位至核内，与其他转录因子一起协同诱导促炎因子IL-1、IL-6、IL-8等基因的表达，参与天然免疫应答。

3.2 MyD88非依赖途径 MyD88非依赖性信号传导途径是某些TLRs(如TLR3、TLR4)所特有，β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)是其中的一个接头蛋白，主要参与INF-β调节因子3(IRF-3)激活。TLR4可通过接头分子Trif介导下游的信号传导，激活转录因子IRF-3和NF-κB，继而介导一系列 NF-κB参与的基因表达、激活Caspase及诱导共刺激分子表达。

经典途径被认为是尿路感染固有免疫最重要的途径。但最新研究表明，在膀胱炎中存在一种cAMP/cAMP反应元件结合蛋白(CREB)途径，且此途径比经典途径更迅速、快捷［10］。此信号途径的启动需要cAMP首先和它相关的传递因子CREB结合。膀胱表面浅层上皮细胞(BECs)上的腺苷酸环化酶(AC)可引起细胞内cAMP上升。AC有四种亚型，其中 AC3为细胞暴露于大肠埃希菌后产生cAMP上升的特异亚型，升高的cAMP可经过蛋白激酶A(PKA)使CREB磷酸化，后者可使IL-6、IL-8表达上调。

4 TLRs与尿路感染

尽管很多种TLRs都在泌尿系统表达，但目前发现只有TLR4、TLR5和TLR11在活体感染时发挥抗菌作用。上述三种基因敲除的小鼠在尿路任意区域发生感染时抗感染能力均减退［4］。在尿路感染中作用最明确的是TLR4。任何细胞缺乏TLR4均将会损伤机体对UPEC的防御机制，增加无症状菌尿(ASB)或脓尿的患病率。Tamm-Horsfall蛋白是健康人尿液中具有抗菌活性的蛋白，可通过TLR4信号途径减轻肾脏炎症损伤和稳定肾外髓质［11］，此进一步证实TLR4在防御泌尿系感染中发挥重要作用。

4.1 膀胱炎 TLR4在膀胱发挥固有免疫作用主要表现在以下三个方面:激活信号转导，产生细胞因子，发挥抗炎作用;抑制细菌侵入;促进细菌排出。TLR4与协同受体CD14广泛表达在鼠和人类BECs上，BECs表面的 TLR4/CD14复合物识别 G-菌的LPS后可激活两种转导途径(经典途径和cAMP/CREB途径)，最终均通过促进IL-6、IL-8的分泌发挥抗感染作用［10］。在膀胱壁浅层内存在一种纺锤体小囊泡，其为一种动态cAMP调节的圆盘状小囊泡，这些小囊泡高度富集脂筏成分，UPEC侵入BECs后装入这些小囊泡内［4］。故BECs上的TLR4还可通过激活cAMP/CREB途径调节cAMP的表达从而抵御UPEC的侵入。细胞内增加的cAMP通过下游的效应分子PKA发挥级联效应抑制Rac-1的活性。Rac-1是BECs上脂筏决定簇的组成成分，并且是肌动蛋白重组和细菌侵入的必要元件。BECs在UPEC侵入细胞后仍能通过TLR4的激活排除细菌，此过程涉及的主要物质仍然是cAMP，因为细胞内的cAMP是纺锤体小囊泡及其携带的细菌发生胞吐的一个强有力的启动子。Bishop等［12］报道，用Forskolin(一种能提高胞内cAMP的物质)处理小鼠，能够引起膀胱纺锤体小囊泡进入浅层浆膜崩溃，随之UPEC在感染的膀胱内数量下降。

4.2 肾盂肾炎 发生肾盂肾炎时，带有I型菌毛或P菌毛的UPEC优先黏附到髓质集合管上皮细胞上形成菌落。一方面机体通过释放ɑ-溶血素刺激Ca2+释放，继而促进 IL-6、IL-8的释放;另一方面UPEC菌毛的LPS成分被TLR4识别，通过MyD88-NF-κB途径引起肾小管上皮细胞产生细胞因子，趋化中性粒细胞启动固有免疫［13］。有研究者通过TLR4突变鼠和野生鼠之间骨髓交叉移植制造了一种新动物模型，结果发现在UPEC感染后，缺乏功能性TLR4小鼠的肾实质细胞不能募集中性粒细胞，不易形成肾脓肿，但在肾内有很多UPEC菌团［14］。以往认为TLR4基因缺失仅可导致ASB;最新研究发现，TLR4发挥固有免疫的另一条途径即MyD88非依赖途径中的IRF-3基因缺失时，机体将发生严重肾脏感染［15］。IRF-3基因缺失的小鼠与对照组相比，早期肾脓肿形成无明显差异，但后期对照组可更早的呈现修复状态。此研究还通过制作LPS敏感及不敏感、MyD88基因缺失的小鼠模型，进一步证实TLR4在肾脏感染时发挥重要作用。

4.3 ASB 新近发现，ASB的发生与宿主的TLR表达有关。ASB患儿中性粒细胞的TLR4表达水平明显低于健康小儿，且原发ASB患儿的TLR4表达水平明显低于初次尿路感染后继发ASB患儿。ASB患儿的TLR4接头蛋白水平升高，TLR4抑制因子水平下降。Fischer等［16］发现，TLR4敲除的小鼠可表现为ASB;Suhs等［17］发现，TLR4缺陷位点的C3H/HeJ小鼠不能清除实验性的UTI，可能是由于不能吸引中性粒细胞聚集到感染的膀胱部位，最终使患者成为一个ASB携带者。

总之，TLRs可控制微生物的致病性、激活宿主的黏膜防御、导致细菌清除，其表达水平及功能与宿主泌尿系感染的类型及转归密切相关。对于尿路感染，目前抗菌药物治疗效果越来越不理想，调节尿道固有免疫系统功能可能成为新的策略，化学药物结合“TLR免疫疗法”(如发现或合成某种物质上调TLRs的表达，或用抗TLRs特异性抗体、构建TLR s缺失基因转染相关细胞来提高机体对尿路致病菌的抵抗与清除能力)亦具有发展前景。

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