重组人血管内皮抑素对放射增敏作用的研究

张蓓蓓综述 高春玲审校

血管生成，是从现有的血管形成新的毛细血管，参与了肿瘤的生长和转移［1］。当肿瘤大小超过 1 ～2 mm3［2］时，血管生成就成为肿瘤进展必不可少的过程［3-7］。Folkman等［2］首次提出，当肿瘤体积＞1 mm3，肿瘤生长所需的养料和氧以及代谢废料的运出必须通过形成新血管，只靠扩散作用是不行的。如果没有生成新的血管，大部分肿瘤将停止生长，处于休眠状态，肿瘤的直径不超过2～3 mm［8］。还有实验发现:将包含 bFGF的缓释聚合物种植在眼睛的虹膜上，会诱导新生血管的形成，当除去这个聚合物时，血管在2～3周内消退了。这个实验显示，在每个组织中都有静止的血管分布，肿瘤必须不断刺激新的血管生成，这种刺激必须大于血管静止水平，以便维持新生血管的生长。否则新生的血管会消退到静止状态。因此，抑制肿瘤血管生成，促使肿瘤细胞进入休眠状态或诱发凋亡是治疗肿瘤的有效途径之一。第一个应用于癌症的血管生成抑制剂已被FDA批准，其中应用最广泛和毒性最小的2种血管生成抑制剂是Caplostatin和Endostatin.Endostatin是一组内源性抗血管生成蛋白的一个成员，对血管生成的抑制是多方面的。最近研究显示，Endostatin不仅有抑制血管内皮细胞的功能，还有直接抗肿瘤作用。

放射治疗是许多人类癌症的重要治疗方法，但往往是不成功的，因为肿瘤细胞的抵抗作用［9-10］。抗肿瘤血管的治疗对血管的作用将直接影响肿瘤的氧分压，从而影响放疗的敏感性，现在联合Endostatin与放疗的治疗成为肿瘤综合治疗的研究热点。现对其研究现状介绍如下。

1 Endosatin的生物学特征

1.1 分子特性

Endostatin是一个分子量为20 kD的胶原蛋白XVⅢC末端的氨基酸片段，包括一个茎环结构和β一片层。在Endostatin分子中，有42%的疏水性氨基酸残基。而且在Endostatin的表面，有对肝素高度亲和力的精氨酸残基。人源的Endostatin和鼠源的Endostatin有很高的同源性，两者的氨基酸残基大部分完全一致，约占86%。但是，人源的Endostatin与鼠源的 Endostatin相对比，人源的 Endostatin C端多了一个赖氨酸残基［11］，N端比鼠源的Endostatin少了12个残基。

1.2 肝素结合位点

在Endostatin的分子中，有一个与肝素亲和力很高的碱性区域，这个碱性区域由11个精氨酸残基构成，也是Endostatin发挥作用的关键区域。Yamaguchi等［12］研究发现，如果Endostatin的浓度较低时，肝素结合位点对Endostatin的作用没有影响，当Endostatin的浓度增加到一定程度时，肝素结合位点就成了主要的作用位点，影响到Endostatin的作用。Fu等［13］研究提示:Endostatin分子中的的疏松结构和肝素结合位点结合后将更利于Endostatin发挥它的生物学作用。

1.3 Zn2+结合位点

Ding等［14］通过结构分析，发现Endostatin存在一个Zn2+结合位点，由 His1、His2、His11 、Asp207 组成。Boehm 等［15］曾研究认为该位点是Endostatin抗血管生成的基本要素，但后来多项研究表明，此位点只与Endostatin的结构性有关而与其功能性无关。

2 Endostatin的作用机制

Endostatin的作用机制有:①抑制内皮细胞的增殖，Endostatin特异性地针对新生血管生成，一个很重要的发现即Nucleolin在欲增殖的人类微血管内皮细胞的表面表达，而不在静止的内皮细胞的表面表达。这细胞表面的nucleolin可以结合Endostatin并把它转运到细胞核，在那里Endostatin抑制nucleolin的磷酸化。Nucleolin的磷酸化是内皮细胞增殖的关键。因此，Endostatin对静止的内皮细胞没有增殖抑制的作用，对非血管内皮细胞系细胞、平滑肌细胞等也没有增殖抑制作用［16］;②诱导内皮细胞的凋亡，细胞凋亡是多细胞生物体维持组织稳态、消除不必要的或已经损坏的细胞的一个重要的过程。一些证据表明，在成人血管，内皮细胞凋亡可能限制血管生成和导致血管的衰退［17］。尤其是在肿瘤组织中，内皮细胞的凋亡通过阻断新血管的形成可以有效地防止养分供应。Endostatin可以和血管的内皮细胞受体直接结合，从而引起内皮细胞G1期阻滞和细胞凋亡［18］。Bcl-2家族是1个重要的凋亡调节蛋白家族，包括如Bcl-2 1种抗凋亡分子和Bax 1种促凋亡分子［19］，Endostatin可以通过抑制bcl-2的表达，诱导内皮细胞的凋亡，但并不下调Bax的表达;③抑制血管内皮生长因子，Endostatin可以作用于VEGF的受体，从而直接阻断VEGF的作用［20］;④抑制基质金属蛋白酶，Endostatin可以与pro-MMP2结合形成稳定的复合体，阻止pro-MMP2的激活，此外，还可以与MMP-2的催化活性基团区域相结合，从而抑制其活性［21］;⑤与肝素样的硫酸蛋白结合，Endostatin可以与肝素样的硫酸蛋白相结合，从而抑制血管的生成，而且肝素与很多抑制血管生成的蛋白都有较高的亲和力;⑥与锌离子结合，在Endostatin的晶体结构中，N末端结合了一个锌离子，锌与Endostatin是1∶1的复合物，这就认为Endostatin的生物活性与锌离子可能有关。

3 Endostatin的抗肿瘤作用

血管生成参与肿瘤的生长和转移［22］，当肿瘤体积超过2 mm3时，血管生成就成为肿瘤进展必不可少的过程，肿瘤需要依赖血管生成来提供生长必须的养料并运走废物，否则肿瘤无法生长，因此，阻止肿瘤生成至关重要的过程是抑制血管生成。Endostatin作为1种血管生成抑制剂，抑制了肿瘤周围的新生血管的生成，从而切断了肿瘤的给养途径，起到诱导肿瘤缺血和缺氧的效果，这就是有名的“饿死肿瘤学说”。然而，最新的研究表明，Endostatin可以通过规范肿瘤的血管，减少乏氧细胞的比例，从而减少耗氧量。血管生成促进因子和血管生成抑制因子的共同调节肿瘤新生血管的生成。当促进血管生成因子的表达高于抑制因子时，才会在原有血管生成新的血管，bFGF和VEGF都是血管生成促进因子，Endostatin正是通过竞争性结合硫酸钻蛋白类受体，或者与VEGF的酪氨酸受体直接相互作用，抑制它们特异性地作用于血管内皮细胞，从而达到抑制新生血管的作用。近期有研究发现Endoustatin除了有抗血管生长的活性之外，在某些肿瘤还可以直接发挥抗肿瘤的作用。

Endoustatin抗肿瘤治疗与传统抗肿瘤治疗相比，Endostatin只针对肿瘤的新生血管，这一特点的的优点有:①Endostatin是以内皮细胞为作用的靶细胞，而一个内皮细胞可以支持50～100个肿瘤细胞的生长，所以，针对血管内皮细胞的治疗效果更显著，此外，血管内皮细胞相较于肿瘤细胞，其基因型更稳定，因此不易产生耐药性;②Endostatin只对增殖快速的血管内皮细胞有抑制作用，对正常的组织几乎没有副作用，而血管内皮细胞的增殖速度远远大于正常细胞的增殖速度，因此，Endostatin的安全性较高;③Endoustatin对肿瘤血管有相对的特异性，因为正常成熟组织的毛细血管内皮细胞常常处于静止状态，而肿瘤的血管内皮细胞的增殖通常比较活跃，因而会出现许多相对特异的高表达的标记分子，而这些相对特异的高表达的标记分子通常也是Endostatin作用于肿瘤血管的潜在的靶向分子。

4 Endostatin的双向药效特点

关于Endostatin的一个有趣的特点:在体内，Endostatin抑制循环中的内皮细胞遵循一个双向的模式即U型的药效曲线。比如抗瘤的最佳浓度介于低浓度和高浓度之间。这个特性将指导我们临床使用Endostatin或其他的血管生成抑制剂。这个现象的发生最早见于干扰素-a的抗血管生成的活性，随后在其他的血管生成抑制剂中也相继出现。拥有27个氨基酸片段的Endostatin也观察到了这一双向剂量反应的现象。在一些早期的治疗，疗效通常不好，甚至失败，就是因为在使用Endostatin治疗时，他们使用了过高的Endostatin药物浓度，远远超过了Endostatin的最佳治疗浓度。但是这个现象的出现原因，还没有找到合理的解释。

5 Endostatin与放疗的结合

放射治疗是肿瘤治疗的1种有效手段，在临床上约有一半以上的肿瘤患者在治疗过程中接受过放射治疗。而且精确的放射治疗被认为是放射治疗在21世纪发展的方向，然而精确放射治疗并不能改善恶性肿瘤患者的长期生产率，所以往往单独接受放射治疗的患者治愈率并不高。这可能是因为放射治疗可以上调并增强血管生成通路从而引起放射抵抗，不能控制肿瘤的转移和复发。而且患者在接受放疗后可以看到明显的肿瘤细胞增殖，其原因可能就是上调血管生成通路的结果［23］。在放射治疗后，肿瘤细胞一般都会出现再氧和的现象，但是，也有一些肿瘤对放射治疗没有一点反应，其原因可能就是在放射治疗后增加肿瘤细胞的乏氧、提高肿瘤血管的通透、降低肿瘤血管的灌流量等调节血管生成的因素作用的结果［24-26］。这些影响放射治疗后肿瘤血管生成的因素，共同导致了血管的形成，从而引起了降低放疗的敏感性，导致放疗抵抗的后果。以致对于肿瘤的治疗来讲，放射治疗和血管生成形成了一个难以避免的恶性循环。如果可以打破这个恶性循环，肿瘤治疗的疗效也将明显的提高。这些问题的存在为放疗和抗血管生成抑制剂的联合治疗提供了机会。所以，安全有效的对放射治疗起到增敏作用的抗血管生成抑制剂成为目前研究的关键点。

许多临床研究表明Endostatin可以提高恶性肿瘤对放射治疗的敏感性［27-28］，但其作用机制仍不是很清楚。Teicher等［29］最先发现抑制血管的生成对放射治疗的治疗效果起到加强的作用。随之，很多的亚临床研究都证实了抗血管生成抑制剂对放射治疗有增敏效应提高了放射治疗的效果［24，30-37］。而且有研究发现有许多的抗血管生成抑制剂能在肿瘤治疗的早期通过降低或改善肿瘤的乏氧情况来起到放射增敏的效应。有临床试验研究证明单独使用抗血管生成抑制剂治疗肿瘤，其效果一直令人失望，原因可能是不同的肿瘤产生不同的作用于肿瘤血管的生长因子，所以，要想提高治疗效果，广谱的抗血管生成抑制剂是必须的。而Edostatin是现阶段公认的最有效的抗血管生成抑制剂，而且它可以在肿瘤血管生成的各个过程中发挥作用。目前研究显示最可能机制是:Endostatin可以抑制血管生成因子的活性以及内皮细胞上的受体，从而间接的抑制了血管的生成;促进了血管内皮细胞的凋亡，起到对血管的内皮细胞直接增敏的作用;通过规范肿瘤的血管，减少乏氧细胞的比例，从而减少耗氧量。此外，临床前的研究表明，Endostatin可以使肿瘤血管瞬间的“正常化”，使其更有效的输送养，从而提供一个时间窗增强放射治疗的敏感性［38-46］。其机制认为是多种作用于肿瘤血管内皮细胞的细胞因子使肿瘤的血管在结构和功能上不同于正常组织的血管，而Endostatin可以在肿瘤血管退化前，强化残留的这种不正常的血管，修剪还未成熟的血管，以改善残留的血管形态的完整及功能的正常，从而使肿瘤血管出现瞬间的“正常化”。Endostatin对血管的这些作用，既改善了放疗与血管生成对于肿瘤治疗的一个恶性循环，也提高了肿瘤对放疗的反应。

假设是在放射治疗后诱导了血管的生成，而且开始表达的VEGF可增加血管内皮细胞的渗透性、升高了肿瘤的IFP［47］，这样就和乏氧形成了一个恶性循环［48］;在这种情况下再放疗可能就是无效的。因此，从理论上来看，如果在放疗前就预先给予了Endostatin的治疗，则可以避免这种恶性循环的发生。由于没有关于Endostatin和放疗的最优调度的准则，Endostatin对于放疗的施用时间管理，将是抗肿瘤疗法至关重要的。因此，有关Endostatin与放疗联合的最佳作用时间，是以后的实验研究需要关注的问题。

在很长的一段时间里，认为血管生成抑制剂因为抗肿瘤血管生成，所以可以通过增加肿瘤细胞的乏氧状态来降低肿瘤放疗的效果。但随着进行大量的实验以及临床上的研究，证实了血管生成抑制剂联合放疗将通过减少乏氧细胞的比例，从而减少肿瘤细胞的耗氧量，达到了增强抗肿瘤的效果，而不是传统意义上的理解。而且Endostatin具有极低的毒性，不易产生耐药性，只作用于新生血管，对于已经形成的血管无作用，容易达到有效药物浓度，基于这些优点，Endostatin是一类具有非常良好应用前景的治疗肿瘤的药物。目前，Endostatin的应用受到临床上各方面研究的重视，并且肿瘤的综合治疗中已经取得了一定的成果。

但是，仍有很多问题需要通过我们进一步的研究来证实，而且现阶段的实验大多数在体外和动物上体现，其研究结果可能与临床有一定的不同。因为在体外实验或动物实验，肿瘤血管还没有生成，或者是形成的早期，而在临床上，肿瘤的发现都已经是晚期，这时的血管形成已经成熟，在这样的条件下，Endostatin的作用效果就需要进一步的研究证实，此外，Endostatin与放疗联合的最佳作用时间也是在以后的实验中需要关注的焦点。

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