大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法的建立及鉴定*

范 悦，商亚珍

(河北省中药研究与开发重点实验室/承德医学院中药研究所，河北承德 067000)

神经胶质细胞是神经组织中除神经元以外的另一大类细胞，广泛分布于中枢神经系统和周围神经系统。中枢神经系统胶质细胞有星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞，其中星形胶质细胞数量最多，几乎囊括了所有胶质细胞的功能。星形胶质细胞与神经元之间存在复杂的相互作用，以维持神经系统内环境的稳定，对神经元的生存、正常中枢神经系统生理发育及病理过程都具有重要作用[1-2]。本研究探讨了如何建立实验室内可行的获得高纯度星形胶质细胞的体外培养方法，以期为星形胶质细胞的生物学研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 试剂 DMEM-F12培养基，美国GIBCO公司;胎牛血清，奥地利PAA公司;胰蛋白酶，华美生物工程有限公司;纤维酸性蛋白(GFAP)一抗，北京中杉金桥生物技术有限公司;羊抗兔二抗试剂盒、DAB显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 星形胶质细胞原代培养 新生1-3d的SD大鼠，雌雄不限。剪开皮肤和颅骨，取两块皮质，预冷PBS漂洗1-2次后，仔细剥除脑膜和血管。剪碎，加入0.125%胰蛋白酶置于37℃培养箱中消化30min,消化完全后加入含20%胎牛血清的培养液终止消化。3500r/min离心5min，弃上清，计数，以2×105个/ml的密度接种于用0.1%多聚赖氨酸铺底的培养瓶中。30min后轻轻翻转培养瓶，吸出未贴壁的细胞悬液，重新接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶中，差速贴壁以除去成纤维细胞。37℃、5% CO2培养箱培养，每3d换液一次。

1.3 星形胶质细胞传代培养 培养至10-12d，待细胞80-90%融合时传代。加入适量0.1%胰蛋白酶(以刚刚覆盖细胞层为宜)后立即于倒置显微镜下观察，待大部分细胞突起缩回、变圆时，立即吸出培养液，加入少量含10%胎牛血清的培养液直接吹打，待细胞层脱落。计数，以密度2×105个/ml接种于0.1%多聚赖氨酸包被的培养瓶中，当7-8d细胞80-90%融合时，再次传代。

1.4 星形胶质细胞的鉴定 培养第3代的细胞以5×104个/孔的密度接种于24孔板内事先用0.1%多聚赖氨酸包被的圆形盖玻片上，培养48h后进行免疫组化染色。吸去24孔板中的细胞培养液，加入PBS漂洗2-3次，加入4%多聚甲醛固定细胞30min后行免疫组化染色，一抗稀释度1:100，阴性对照用PBS代替一抗，DAB显色，苏木素复染细胞核，GFAP阳性产物位于细胞浆。

2 结果

2.1 细胞培养结果 刚接种的细胞为圆形，胞体较小，3-6h贴壁。3-4d可见细胞基本呈圆形，长出细小突起。5-7d细胞突起变长，呈梭形、多边形等形状。随培养时间的延长，细胞数量增多，胞体变大，逐渐交织成网状。传代后细胞生长明显加快，3-4h贴壁，2-3d呈多种形态，6-7d细胞80-90%融合。在培养过程中可偶见神经元，但随培养时间的延长和传代逐渐消失。

2.2 免疫组化结果 GFAP阳性产物位于细胞浆，呈棕黄色颗粒状。细胞分两层，上层为纤维性星形胶质细胞，胞核小，突起长而细;下层为原浆性星形胶质细胞，胞核大，椭圆，形状不规则。随机选取若干视野，计数阳性细胞数，显示细胞纯度95%以上。

3 讨论

星形胶质细胞是中枢神经系统的主要间质细胞，构成神经组织网架，具有分裂能力，可分泌和释放多种神经营养因子，能促进神经元生长，形成神经元微环境，具有神经营养功能[3]。

体外培养的胶质细胞，并非来自已经完全分化的星形胶质细胞和小胶质细胞，而是它们的前体细胞在体外培养系统中经发育、分化，最终成为成熟的胶质细胞。因此，取材时间最好在出生后的早期，此时前体细胞的数量接近峰值[4]。另外，使用新生1-3d大鼠的原因是出生后神经元不再分裂，可尽量减少神经元的污染，且神经元不能传代，经过数次传代即可去除神经元。而星形胶质细胞大量增殖发生在胚胎晚期和出生后，生长旺盛[5]。而且1-3d新生大鼠脑膜和血管较好剥离，尽量剥除脑膜和血管可以减少成纤维细胞的污染[6]。

本研究免疫组化结果显示，培养的为混合星形胶质细胞，细胞分为上下两层，纤维性星形胶质细胞和原浆性星形胶质细胞都属于星形胶质细胞，可根据实验需求不同，将两种细胞分开培养[7]。原浆性星形胶质细胞多分布于脑和脊髓的灰质，含胶原纤维少，细胞体较大，突起宽而扁，分支少;纤维性星形胶质细胞多分布于脑和脊髓的白质，细胞内富含胶原纤维，突起细长，分支多[8]。

星形胶质细胞是神经胶质细胞中数量最多的一种除了以往认识的在神经系统中有营养支持作用外，与神经元之间还存在复杂的相互作用，也与许多神经退行性疾病密切相关，尤其是神经炎症反应，由星形胶质细胞和小胶质细胞释放的细胞因子介导。胶质细胞的异常改变直接影响神经功能的正常发挥[9-10]。因此，建立星形胶质细胞体外培养的方法有利于探讨星形胶质细胞在神经退行性疾病中的角色，以及研究药物的作用及机制。

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