HPLC检测复合鱼肝油制剂中维生素A含量的可行性

李东文

复合鱼肝油制剂是由鱼肝油、维生素及其他辅料制成的，鱼肝油是由海鱼中提炼的一种脂肪油，主要成分是维生素A，可促进视觉细胞内感光色素的形成，调试眼睛适应外界光线强弱的能力，以降低夜盲症和视力减退的发生，维持正常的视觉反应。此外鱼肝油中的维生素D有助于促进人体对钙的吸收，有助于预防婴幼儿缺乏维生素D会引起佝偻病，成人缺乏维生素D会造成骨骼软化症［1］。维生素A摄入过量也会引起副作用，可损害脑组织等，因维生素制剂含量的控制十分重要［2］，目前维生素A常用的检测方法有荧光光分度法、液相色谱法等［3］，本文笔者采用高效液相色谱法检测复合鱼肝油制剂中维生素A的含量，为复合鱼肝油制剂的质量监控提供依据。

1 仪器与试剂

采用岛津LC-10ATVP高效液相色谱仪，AT-201电子分析天平(瑞士梅特勒)，岛津UV-2550紫外-可见分光光度计;维生素A对照溶液(广州珠江制药厂提供);复合鱼肝油制剂由山东达因海洋生物制药股份有限公司提供，规格为500ml/瓶，批号为 101005、101012、101024。

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱 设定色谱柱为Kromasil+C18(250 mm×46 mm)，流动相为甲醇-水98∶2，设置流速为1 ml/min，检测波长为328 nm。

2.2 对照溶液的制备 取广州珠江制药厂提供的维生素A醋酸酯50 mg，由天平称量后放于50 ml容量瓶中，容量瓶中放入环己烷配置维生素A醋酸酯浓度为1 mg/ml的对照溶液准备溶液。进行对照实验时用吸管吸取准备液1 ml，放入50 ml容量瓶中，采用甲醇稀释，获得维生素 A醋酸酯浓度为0.02 mg/ml的对照溶液溶液。

2.3 测试溶液制备 精密抽取复合鱼肝油制剂5 ml放于分液漏斗中，加无水乙醇20 ml后摇匀，然后加入环己烷25 ml，用力摇匀后静置，弃水层后留置液体采用无水硫酸钠滤纸过滤，取滤液5 ml置于25 ml容量瓶中，采用甲醇稀释至刻度即得测试溶液溶液［4］。阴性测试溶液选择不含维生素A的样品，制备方法同测试溶液。

2.4 线性关系判定 分别抽取维生素A醋酸酯准备液1、2、3、4、5 ml，分别采用乙醇稀释为浓度为 22.036、44.168、66.304、88.262、110.350 的对照溶液溶液，分别进样 20 μl后行色谱测定，色谱条件按2.1进行;以对照溶液进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，数据计算后可得如下回归方程，Y=60 172 X+61 689，r=0.998 6。由回归方程可见，在 22.036 ～11.350 mg/L范围内，维生素A进样量与峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度实验 抽吸测试溶液溶液进样20 μl进行色谱测定，重复进样色谱测定6次，均测量维生素A的峰值面积，6次测量结果RSD为0.19%。

2.6 对照实验 分别精密抽取对照溶液、测试溶液、阴性测试溶液，均进样20 μl后进行色谱测定，维生素A色谱显示清晰，阴性测试溶液未见维生素A干扰峰出现。见图1。

图1 高效液相色谱图

2.7 稳定性实验 取同一测试溶液，在常温下0、2、4、6、8、10小时时进样20 μl分别进行色谱测定，统计分析6次测量的维生素A的峰值面积，计算RSD为0.45%。

2.8 回收率实验 取101012批次样品9份，分别加入定量的对照溶液，然后按2.3方法制备测试溶液后，9份现制备的测试溶液分别进样20 μl，然后测定回收率，见表1。

表1 6份样品加样回收实验

2.9 样品含量测定实验 取3个批次待检鱼肝油制剂，每个批次选择3份样品，按2.3方法制定测试样品，进样数20 μl后测定样品含量，然后计算整瓶样品中维生素含量。见表2。

表2 3个批次9份样品维生素A含量测定

3 讨论

鱼肝油是由海鱼的肝脏内提炼的油脂，其中含有大量维生素，包括维生素A维生素D中，可有效预防小儿夜盲、佝偻症，成人骨软化症等。鱼肝油收录于《药典》2005版本，目前维生素A含量测定方法主要有高效液相色谱法、紫外分光光度法、荧光分光光度法［5］。

本文高效液相色谱法对鱼肝油中的维生素A进行质量控制。流动相采用甲醇-水(98∶2)，原因在于实验研究显示98∶2甲醇-水流动相相对95∶5，90∶10流动相有更好的分离效果及峰值波形［6］。另外《药典》中供试品溶液的制备直接采用环己烷溶解，但是鱼肝油复合制剂中辅料较多，会干扰波形，并且按传统质量控制标准采用无水乙醇、环己烷、水共提，溶液不易分层，并且会出现乳化现象［7］，本文笔者采用环己烷和无水乙醇共同提取，原因在于研究显示环己烷无水乙醇共同提取，提取率可达原标准的98%，而单独环己烷提取，提取率仅达原标准的68%。

总之，本研究显示，HPLC检测复合鱼肝油制剂中维生素A含量方法简单，波形清晰，结果可靠，精密度和回收率均较高，可作为该制剂主要含量控制方法。

1 陈咏，楼永明.固相萃取-HPLC法测定鱼肝油乳中维生素A的含量.海峡药学，2009，21:46

2 潜丽俊，刘晟，杨丽军.慢性维生素A中毒16例误诊分析.浙江临床医学，2002，4:465-466.

3 Song JC，Li YQ，Zeng JF.Determination of Vitamin D2，Vitamin A and Vitamin E in Cernevit-12 for Injection by HPLC.China Pharmacy，2007，18:2456-2457.

4 黄敏，黄增琼，蒋伟哲，等.高效液相色谱法测定复合鱼肝油制剂中维生素A的含量.广西医科大学学报，2007，24:600-601.

5 国家药典委员会主编.中国药典2005版.二部.附录.北京:化学工业出版社，2005.46-47.

6 Shaoqing HU.Determination of Vitamin A in Compound Morrhuate Preparation by HPLC.China Medical Herald，2011，8:101-102.

7 胡漳程.HPLC法测定三维鱼肝油乳中的维生素A含量.海峡药学，2009，21:68-69.