融合 Th细胞表位序列 Myostatin重组基因疫苗的构建及其对免疫动物肌肉力量的影响*

唐 量，刘晨涛，王园丽，罗 凯，王旭丹

（陕西师范大学体育学院运动分子生物学实验室，西安710062）

肌肉萎缩一直是人们普遍关注和重视的问题，近年来在肌肉萎缩等相关疾病研究方面Myostatin作为新的靶分子倍受关注［1］。Myostatin基因敲除后出现“双肌”症状被认为是骨骼肌生长发育中的关键负调控因子［2］。本课题组近年来报道了 Myostatin重组蛋白的构建、表达和纯化［3］及重组蛋白疫苗对小鼠骨骼肌质量和力量的影响［4］。本实验在前期研究的基础上，拟利用基因工程技术构建与 Th细胞表位TT830-844序列融合的人重组 Myostatin基因疫苗真核表达载体pVAC-TT-Ms，为重组Myostatin基因疫苗改善肌肉萎缩等病症的后续研究提供实验基础。

1 材料与方法

1．1 基因疫苗的构建及体外表达检测

1．1．1 实验材料 真核表达载体 pVAC1-cms及抗生素 Zeocin为 Invivogen公司产品；pQE30质粒和LipofectinTM2000脂质体转染试剂购自Invitrogen公司；核酸片段纯化试剂盒和质粒纯化试剂盒购自Omega公司；限制性内切酶均为 TaKaRa公司产品；兔抗人Myostatin多克隆抗体为 Bethyl公司产品，荧光标记羊抗兔二抗购自华美生物工程公司。

1．1．2 重组质粒 pVAC-TT-Ms的构建 TT表位序列（Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu）来源于破伤风毒素，具有激活Th细胞的作用。根据Genebank报道的人Myostatin cDNA序列（No．014793）C-端 330 bp基因片段，合成融合 TT表位的TT-Ms基因序列并克隆至pQE30原核表达载体，重组质粒为pQE-TT-Ms，由上海生物技术工程公司完成基因片段的合成。

为构建融合TT表位的Myostatin基因真核表达载体，利用PCR技术在TT-Ms基因序列5′端和3′端的添加 BamH I和 EcoR I酶切位点。上游引物：5′-CGGGA TC CATT TTG GTC TTG ACT GTG-3′，下游引物：5′-GC GAA TTC TGA GCA CCC ACA GCG-3′，引物由上海生物技术工程公司合成。

PCR扩增体系：总体积为50μl，其中1μl pQETT-Ms模板质粒，5μl的10×PCR缓冲液，5μl MgCl2（25 mmol／L），1μl 4×dNTPs（25 mmol／L），上游和下游引物各 1μl（25μmol／L），1μl Taq DNA聚合酶，用水补足体积至50μl。PCR扩增（PCR仪，美国 Bio-Rad）：95℃预变性 2 min后，94℃变性 1min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环共30次，最后72℃再延伸10 min。

1．1．3 重组质粒 pVAC-TT-Ms的鉴定和纯化 用BamH I和EcoR I双酶切pVAC1-cms质粒，回收酶切基因片段。PCR产物用1．2%琼脂糖凝胶电泳分离后，回收目的片段。将目的基因片段 TT-Ms克隆至真核表达载体pVAC1-cms，得到重组质粒 pVAC-TTMs。重组质粒转染宿主细胞 DH5α，将阳性克隆转接于LB培养基中，培养约8 h后提取质粒，进行酶切鉴定和DNA序列分析。将测序正确的质粒在含Zeocin抗生素的LB培养基中进行扩增，采用聚乙二醇沉淀法对重组质粒pVAC-TT-Ms进行纯化。

1．1．4 重组质粒 pVAC-TT-Ms转染CHO细胞及目的蛋白的表达检测 利用细胞免疫荧光技术对目的蛋白在真核细胞中的表达进行检测。具体方法为：将CHO细胞用含100 ml／L胎牛血清的低糖DMEM培养基于37℃、体积分数为5%的 CO2条件下培养。以一定密度分别接种于含盖玻片的6孔板中，继续培养24～48 h，使80%以上的细胞贴壁。吸出培养液，在无菌管中各加入2μg纯化的pVAC-TT-Ms质粒和pVAC1-cms质粒，再分别加入100μl无血清和无抗生素的DMEM培养基；在另两只无菌管中各加入10μl LipofectinTM2000和90μl无血清和抗生素的培养基，室温放置10 min；分别与前两管溶液混合，轻轻混匀，室温放置15 min。分别向脂质体和质粒溶液中加入800μl无血清无抗生素的DMEM，轻轻混匀，移入洗过的CHO细胞中，孵箱中培养7 h，换加1 ml含200 ml／L小牛血清无抗生素的DMEM，在转染36 h后收获细胞。取出盖玻片，用预冷的丙酮固定细胞10 min，在盖玻片滴加10%小牛血清，室温封闭30 min，吸掉。滴加兔抗人Myostatin多克隆抗体后4℃冰箱放置过夜。滴加FITC标记的羊抗兔IgG，37℃孵育60 min。甘油封片后立即于荧光显微镜（E1000，日本Nikon公司）下观察并照相。

1．2 动物免疫及抓力测试

由第四军医大学实验动物中心提供雄性BALB／c小鼠，体重 12～14 g，适应性喂养 1周后将动物分为三组：正常对照组、空质粒对照组和基因疫苗组（n＝8）。基因疫苗组和空质粒对照组小鼠以纯化的质粒 pVAC-TT-Ms和 pVAC1-cms作为抗原，每只按100μg股四头肌内注射，每隔14 d免疫一次动物，共免疫4次。正常对照组在相同时间和部位注射相同剂量的PBS。第四次免疫20 d后进行抓力测试，方法参考并改进 Peled-Kamar等报道的动物前肢抓力测试方法。主要步骤为在离地高80 cm处绑紧一根直径2 mm的绳子，让小鼠前肢握住绳子，并固定尾部，记录小鼠掉落前持续握住绳子的时间，即完成一次抓力测试。每只小鼠抓力测试重复3次，重复间隔时间保持一致。

1．3 数据统计学处理

所测数据用 SPSS 13．0软件进行统计处理，实验结果以均数±标准差（¯x±s）表示，数据进行组间均值非成对 t检验。

2 结果

2．1 重组质粒 pVAC-TT-Ms的构建

琼脂糖凝胶电泳结果显示，在约400 bp处有一条与预期大小相符的条带（图1）。TT-Ms基因片段经 EcoR I和 BamH I双酶切，与同样双酶切的pVAC1-cms质粒进行连接，得到重组真核表达质粒pVAC-TT-Ms。经 EcoR I和 BamH I酶切鉴定，发现在约400 bp处有一条带（图2），与预期大小相符。构建的重组质粒pVAC-TT-Ms经DNA测序，结果完全正确（图 3）。

Fig．1 PCR production of MyostaitnLane 1：DNA marker；Lane 2：PCR production

Fig．2 Restriction analysis of recombinant plasmids pVAC-TT-Ms Lane 1：DNA marker；Lane 2：Restriction production

Fig．3 Sequencing result of recombinant plasmids pVAC-TT-Ms

2．2 重组质粒pVAC-TT-Ms的纯化

质粒纯化结果显示，pVAC1-cms质粒含量为1．25μg／μl，pVAC-TT-Ms质粒含量为 1．32μg／μl；pVAC1-cms质粒和pVAC-TT-Ms质粒OD260／OD 280比值分别为1．78和1．82，证明质粒不含蛋白质等杂物；电泳结果显示纯化质粒超螺旋、螺旋和线形条带明晰（图4）。以上结果证明纯化质粒符合转染细胞的质量要求。

Fig．4 Purification of recombinant plasmids pVAC-TT-Ms

2．3 细胞免疫荧光检测真核细胞中目的蛋白的表达

细胞免疫荧光技术检测纯化质粒瞬时转染36 h后的CHO细胞。结果显示，重组pVAC-TT-Ms质粒转染的CHO细胞明显着色，而空质粒pVAC1-cms转染的 CHO对照细胞无荧光着色（图5），证明重组pVAC-TT-Ms质粒体外可以在真核细胞CHO中表达目的蛋白。

Fig．5 Detecting the transferring CHOcells with cell immunofluorescence technique（×200）A：CHOcell transfected with pVAC1-cms plasmids；B：CHO cell transfected with pVAC-TT-Ms plasmids；CHO：Chinese hamster ovary

2．4 重组Myostatin基因疫苗对免疫小鼠抓力的影响

小鼠抓力测试结果显示，对照组小鼠前肢抓力平均时间为（33．50±2．72）s，融合 TT表位的重组Myostatin基因疫苗pVAC-TT-Ms免疫的小鼠前肢抓力平均时间为（47．78±3．51）s，与对照组比较提高显著，免疫小鼠前肢抓力平均增加了29．88%（图6A）。为了排除体重对抓力的影响，进一步分析免疫小鼠抓力与体重的比值，结果与正常对照组小鼠比较，基因疫苗免疫小鼠平均增加了24．31%，增加显著（图 6B）。

3 讨论

废用性肌肉萎缩一直是人们普遍关注和重视的问题，许多学者对废用性肌萎缩的治疗进行了深入研究，但仍无突破性进展。Myostatin作为骨骼肌生长发育的关键负调控因子，在废用性肌肉萎缩方面的研究倍受关注。

本实验选用人重组 Myostatin基因疫苗免疫诱导特异性抗体进而抑制其体内活性，而构建人重组Myostatin基因疫苗的关键是打破免疫耐受。Th细胞表位TT序列，有利于自身的免疫系统所识别，诱发免疫反应。本实验在构建 Myostatin基因疫苗时N-端融合了Th细胞表位TT序列，以打破Myostatin免疫时耐受，增强Myostatin基因疫苗的免疫效果。

Fig．6 Grip test in immunized miceA：Relationship of grip time（x-axis）to body weight（y-axis）for each animal；B：Average value of the grip time／body weight．The average value of the time／body weight of the mice immunized with pVAC-TT-Ms was about 24．31%greater than that of control mice*P＜0．05 vs control

质粒pVAC1-cms是一种高效和安全的基因疫苗专用质粒。将Myostatin成熟肽基因片段克隆至pVAC1-cms质粒IL-2的信号肽序列和胎盘碱性磷酸酶（PLAP）的跨膜锚定位点序列之间，确保表达的抗原蛋白被锚定在细胞的表面，以增强免疫应答。重组质粒pVAC-TT-Ms由脂质体介导，转染CHO细胞，使外源目的蛋白整合稳定，并高效扩增和表达目的蛋白。

本实验将多种优势结合，首次构建融合 Th细胞表位序列人重组 Myostatin基因疫苗真核表达载体pVAC-TT-Ms，瞬时转染 CHO细胞并免疫荧光技术检测，目的蛋白在转染的 CHO细胞中明显表达。测定OD260和OD280比值和电泳分析表明，重组质粒pVAC-TT-Ms质量符合免疫动物时基因疫苗的要求。重组质粒pVAC-TT-Ms免疫小鼠可显著提高免疫小鼠前肢的抓力。

Whittemore等［5］报道动物体内注射 Myostatin的特异性抗体，可抑制 Myostatin的活性，进而提高动物骨骼肌质量和力量。虽然 Myostatin抗体在治疗肌肉相关疾病的过程中效果良好，由于纯化困难、造价昂贵等不便限制了抗体的广泛应用，因此，研发针对该蛋白主动免疫的疫苗有更好的应用前景。下一步课题组计划比较 Myostatin基因疫苗的量效和时效关系，分析该疫苗提高免疫动物骨骼肌质量和力量的分子机制，为重组 Myostatin基因疫苗治疗废用性肌肉萎缩等病症方面的应用提供实验基础。

［1］ Elkina Y，von Haehling S，Anker SD，et al．The role of myostatin in muscle wasting：an overview［J］．J Cachexia Sarcopenia Muscle，2011，2（3）：143-151．

［2］ McPherron A C，Lawler A M，Lee SJ．Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member［J］．Nature，1997，387（6628）：83-90．

［3］ 唐 量，王园丽，张万金，等．Myostatin基因原核表达载体的构建及蛋白表达、纯化与鉴定［J］．陕西师范大学学报（自然科学版），2010，38（6）：77-81．

［4］ 唐 量，张万金，王园丽，等．Myostatin重组蛋白疫苗对小鼠骨骼肌质量和力量的影响［J］．中国运动医学杂志，2011，30（2）：149-153．

［5］ Whittemore L A，Song K，Li X，et al．Inbibition of myostatin in adult mice increnses skeletal muscle mass and strength［J］．Biochem Biophys Res Commun，2003，300（4）：965-971．