AMPKα及p-AMPKα在运动过程中不同纤维类型骨骼肌中的表达变化*

王 璐，张 鹏，刘红菊，许寿生，陈晓萍△

（1．中国航天员科研训练中心，北京100094；2．北京体育大学，北京100084）

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是由α、β和γ亚单位构成的异源三聚体，在整个机体的能量代谢过程中起着中心控制作用，是真核生物能量代谢变化的感受器。以往研究证明，无论在一次性运动还是在长期耐力训练中，肌肉收缩所引起的能量变化（AMP上升，ATP下降）［1］均可以激活 AMPK，p-AMPKα表达增加［2］。本研究利用小鼠跑台实验，进一步检测了AMPKα亚基在运动过程中不同纤维类型骨骼肌中的动态表达，为阐明AMPKα亚基在骨骼肌运动过程中的重要作用奠定实验基础。

1 材料与方法

1．1 实验动物及分组

本实验选用8周龄健康雄性 C57BL／6小鼠18只，体重（20±1）g（北京维通利华公司购买），常规分笼饲养，室温保持在（23±2）℃，光照12 h／d，标准啮齿类动物饲料饲养，自由饮食。预适应一周，随机分为三组（n＝6）：对照组（运动前）、运动中（运动1 h后）和运动耗竭。

1．2 小鼠跑台实验

参照文献方法［1］将小鼠放入跑台，水平状态下每天以10 m／min运动15 min，预适应一周后，运动前组直接取小鼠后肢背侧腓肠肌、比目鱼肌以及跖肌。运动中、运动耗竭组小鼠放入跑台以水平状态15 m／min的速度进行运动，并分别在运动1 h后和运动耗竭时取小鼠后肢背侧腓肠肌、比目鱼肌以及跖肌，提取总蛋白［2］。

1．3 主要试剂

AMPKα（Cell signaling，2532），p-AMPKα（Cell signaling，2531S），beta-actin（北京中山生物公司），辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（北京中山生物公司）。

1．4 Western blot

（1）取50～100 mg组织加入到1 ml组织裂解液中（已加入蛋白酶抑制剂），用匀浆器在冰上充分匀浆，冰上裂解30 min；（2）4℃，12 000×g离心 20 min，取上清，取标准溶液和适当稀释的待测样品各20μl，加入5倍稀释的蛋白浓度分析试剂中，595 nm波长测光密度值。以标准蛋白浓度的光密度值作标准曲线，计算待测样品蛋白浓度；（3）分别配制12%的分离胶和5%的积层胶，灌制分离胶和积层胶，在样品加入凝胶加样缓冲液，沸水变性3～5 min后每孔80μg上样；（4）电泳：恒压电泳，电泳至凝胶底部；取下凝胶，放入预冷的电转缓冲液中平衡10 min；（5）NC膜在预冷的电转缓冲液中平衡10 min，在湿转式电转仪上以恒流进行电转；（6）电转结束后，将膜置于TBS中漂洗3次，每次10 min。封闭，室温轻摇2 h。剪下目的条带，按照0．1 ml／cm2的比例分别加入用封闭液稀释的抗AMPKα、p-AMPKα一抗，4℃轻摇过夜；（7）TBST洗 3次，每次10 min。按照0．1 ml／cm2的比例加入封闭液稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗，在室温振荡2 h。（8）TBST洗3次，每次10 min，ECL显色。

1．5 统计学分析

采用Image-Pro Plus灰度分析后，利用SPSS11．0进行数据处理，数据以均数±标准差x±s）表示，两组间比较行 t检验。

2 结果

2．1 AMPKα及p-AMPKα在小鼠运动过程中腓肠肌中的表达变化

Western blot的结果显示，同对照组（运动前组）对比，AMPKα在小鼠运动过程中腓肠肌中的表达并无太大变化；而p-AMPKα在运动1h后直至耗竭表达持续增多，分别为对照组的 2．14倍和 3．23倍（P＜0．01，图 1）。

2．2 AMPKα及p-AMPKα在小鼠运动过程中比目鱼肌中的表达变化

同对照组（运动前组）对比，AMPKα在小鼠运动过程中比目鱼肌中的表达也没有太大变化；而p-AMPKα在运动1 h后表达增加至对照组的4．18倍，至运动耗竭时略为下降，但仍远比对照组表达较高，为对照组的3．8倍（P＜0．01，图2）。

Fig．1 Expression of of AMPKαand p-AMPKαin gastrocnemius of mice during exercise（¯x±s，n＝6）1：Control group；2：Running group；3：Exhaustion group**P＜0．01 vs control group

Fig．2 Expression of of AMPKαand p-AMPKαin soleus muscles of mice during exercise（¯x±s，n＝6）1：Control group；2：Running group；3：Exhaustion group**P＜0．01 vs control group

2．3 AMPKα及p-AMPKα在小鼠运动过程中跖肌中的表达变化

同对照组（运动前组）对比，AMPKα在小鼠运动过程中跖肌中的表达也没有太大变化；而p-AMPKα在运动1 h后表达增加至对照组的2．51倍，至运动耗竭时下降至对照组1．5倍（P＜0．05，P＜0．01，图 3）。

Fig．3 Expression of of AMPKαand p-AMPKαin plantaris muscles of mice during exercise（¯x±s，n＝6）1：Control group；2：Running group；3：Exhaustion group*P＜0．05，**P＜0．01 vs control group

3 讨论

AMPK作为骨骼肌内重要的能量感受器［1］，对于维持骨骼肌运动时的能量供应至关重要。在本研究中我们发现，小鼠运动1 h直至运动耗竭，在AMPKα蛋白表达水平基本保持不变的情况下，p-AMPKα在小鼠后肢背侧腓肠肌、比目鱼肌和跖肌中的表达均显著增加。

p-AMPKα的表达增加可以磷酸化下游与骨骼肌有氧代谢过程相关众多关键限速酶。研究表明，激活的AMPK可以促进葡萄糖转运体的表达增加及其向胞膜的囊泡转运增强骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取，激活糖酵解途径的限速酶促进葡萄糖在体内的分解代谢［2］；激活的AMPK也可以磷酸化ACC抑制脂肪酸的合成，并通过NRF和PGC-1α促进线粒体内氧化呼吸链活动性增强；还可以抑制蛋白质的合成，促进蛋白质分解［4］。因此，运动时p-AMPKα表达增加的意义在于，通过促进产能的分解代谢，抑制耗能的合成代谢来保证运动时骨骼肌的能量供应。遗传学的证据同样证明，AMPKα亚型失活可使小鼠最大运动速度下降45%，运动时间减少55%［5］。转基因动物的研究进一步验证了AMPK对于保证运动时骨骼肌的能量供应的重要性。

研究中我们还发现，p-AMPKα在小鼠后肢肌肉中的表达变化尤其以比目鱼肌中最为显著，在跖肌中的表达变化幅度最小。骨骼肌按照本身的代谢类型特性可分为慢肌和快肌，分别由慢肌纤维蛋白和快肌纤维蛋白组成。慢肌又称为红肌，以有氧代谢为主，收缩缓慢、持久，不易产生疲劳，比目鱼肌为典型的慢肌；快肌也称白肌，以无氧酵解代谢为主，收缩快，爆发力强，但容易出现疲劳，跖肌是典型的快肌。相对于快肌跖肌，p-AMPKα在慢肌比目鱼肌中的显著变化能够充分激活下游的有氧代谢反应，以便快速供应肌肉能量。因此，p-AMPKα在运动过程中不同纤维类型肌肉中的变化差异可能与肌肉自身的代谢特征有关，相同的运动强度和运动方式对不同纤维类型的肌肉影响程度并不相同。这也提示，对不同专项运动员、身体不同部位肌肉进行有针对性的训练可大大提高训练效率。

因此，在本研究中，我们进一步验证了运动时AMPK对于保证骨骼肌的能量供应的重要性，同时发现相同的运动强度和运动方式对不同纤维类型的肌肉影响幅度并不相同。进一步阐明AMPK各亚基在骨骼肌运动过程中的重要作用，对于指导运动员进行针对性训练，提高运动锻炼效果具有重要的实际意义。

［1］ Narkar V A，Downes M，Yu R T，et al．AMPK and PPAR agonists are exercise mimetics［J］．Cell，2008，134（3）：405-415．

［2］ Ljubicic V，Miura P，Burt M，et al．Chronic AMPK activation evokes the slow，oxidative myogenic program and triggers beneficial adaptations in mdx mouse skeletal muscle［J］．Hum Mol Genet，2011，20（17）：3478-3493．

［3］ Lee-Young R S，Ayala JE，Fueger PT，et al．Obesity impairs skeletal muscle AMPK signaling during exercise：role of AMPKα2 in the regulation of exercise capacity in vivo［J］．Int J Obes（Lond），2011，35（7）：982-989．

［4］ Iversen N，Krustrup P，Rasmussen H N，et al．Mitochondrial biogenesis and angiogenesis in skeletal muscle of the elderly［J］．Exp Gerontol，2011，46（8）：670-678．

［5］ Jorgensen SB，Treebak JT，Viollet B，et al．Role of AMPKalpha2 in basal，training-，AICAR-induced GLUT4，hexokinase II，and mitochondrial protein expression in mouse muscle［J］．Am J Physiol Endocrinol Metab，2007，292（1）：E331-E339．