肢体缺血预处理对大鼠海马CA3区和齿状回区p38 MAPK和HSP 70表达的影响*

孙晓彩，李文斌，赵 丽，贾会贤，王 芳，张 敏，李淑琴

（1．河北医科大学病理生理学教研室，2．河北省医学生物技术实验室，石家庄050017；3．河北省公安厅，石家庄050000）

我室研究证实，反复3次股动脉夹闭和开放的肢体缺血预处理（limb ischemic preconditioning，LIP）可减轻随后即刻发生的全脑缺血／再灌注引起的大鼠海马CA1区锥体神经元的延迟性死亡和凋亡、诱导脑缺血耐受，从而发挥脑保护作用［1-3］。此外，分别应用p38 MAPK及HSP 70特异性抑制剂能部分阻断LIP的脑保护作用，证实了LIP通过上调大鼠海马CA1区p38 MAPK和HSP 70的表达诱导了脑缺血耐受，并证实了LIP通过p38 MAPK上调了HSP70的表达［4］。在我们的实验中，8 min全脑缺血打击使得大鼠海马CA1区神经元几乎全部死亡，而CA3区和齿状回（dentate gyrus，DG）区的神经元则相对耐受、无神经元的明显死亡，这一结果与既往研究者的结论是相同的［5，6］。正是由于CA3区和DG区对缺血性损伤相对耐受，很少有研究者注意到预处理对这两个区域细胞内物质表达的影响。如果大脑面临较长时间的缺血打击，也必将使CA3区及DG区的神经元发生死亡，LIP能否通过上调p38 MAPK和HSP 70的表达在上述区域也发挥脑保护作用，尚未见文献报道。因此，本研究旨在探讨LIP对大鼠海马CA3区及DG区p38 MAPK和HSP 70表达的影响，为进一步探讨CA3区和DG区的缺血耐受机制提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 实验动物及分组

健康雄性Wistar大鼠（250～300）g 96只，由河北医科大学实验动物中心提供，随机分为8组（n＝12，6只用于免疫组织化学，6只用于 Western blot）：（1）sham组：只暴露双侧股动脉50 min，但不夹闭；（2）LIP组：夹闭双侧股动脉 10 min、再灌流 10 min、反复3次，根据LIP后再灌注的时间进一步分为LIP 6 h、LIP 12 h、LIP 1 d、LIP 2 d、LIP 3 d、LIP 4 d和 LIP 5 d亚组，于LIP后相应时间点取材。

1．2 肢体缺血预处理

乙醚麻醉大鼠，仰卧位固定，在双侧后肢股三角处剪毛，沿血管走行切开皮肤、皮下组织，钝性分离缝匠肌后部，游离股动脉，用无损伤小血管夹夹闭股动脉10 min，松开血管夹再灌流10 min，反复3次。手术过程中，创口局部施予局麻药（1%普鲁卡因）防止疼痛。LIP后缝合创口，局部应用庆大霉素预防感染。

1．3 免疫组织化学

于预定的时间点将动物深麻（10%水合氯醛，350 mg／kg），生理盐水（0℃ ～4℃，约 150 ml）、4%多聚甲醛（0℃～4℃，约200 ml）灌注固定。冠状切取视交叉后3 mm脑片，4%多聚甲醛固定，4℃过夜。石蜡包埋，常规制作石蜡切片，片厚5～6μm。二甲苯、梯度酒精（100%～70%）脱蜡至水，3%H2O2室温孵育15 min消除内源性过氧化物酶。微波修复抗原，血清封闭，滴加p-p38 MAPK一抗（兔抗鼠多克隆抗体，Cell Signaling，Cat no．：4631S，lot no．：4）或HSP 70一抗（兔抗鼠多克隆抗体，Neomarkers，Cat no．：RB-080-A0，lot no．：080A604B），浓度均为 1∶120，4℃过夜。滴加生物素标记的二抗（羊抗兔IgG，Santa Cruz，Cat no．：SP-9001，lot no．：50581654），37℃孵育50 min，DAB显色，脱水透明，封片。在光镜下观察海马CA3区及DG区阳性细胞的形态及分布特征。通过彩色图文分析系统，计数视野内阳性细胞平均光密度及总面积，以反映免疫组织化学染色的程度。每个标本测量5个视野，取其平均值。

1．4 海马CA3区和DG区Western blot检测

以上各组动物在预定时间点迅速断头取脑，在0℃～4℃生理盐水中分离出双侧海马CA3区和DG区，分析天平称重后加入5倍体积的预冷裂解液制成匀浆。裂解液含有 20 mmol／L Tris-HCl（pH 7．5）、1 mmol／L EDTA、5 mmol／L MgCl2、1 mmol／L DTT、10 g／ml pepstatin A、2 mmol／L sodium orthovanadate、50 mmol／L NaCl和 1 mmol／L PMSF。 取 上 清 分 装，－80℃保存待测。采用改良酚试剂法测定海马CA3区和DG区组织蛋白的含量。取蛋白样品加入等体积2×SDS凝胶加样缓冲液后于95℃～100℃煮5 min，将样品分别加入10%SDS-PAGE凝胶加样孔中，恒压电泳（浓缩胶 80 V，分离胶 100 V），预染marker指示下切胶，恒压（60 V，2 h）条件下将蛋白转移到PVDF膜上。TTBS洗膜3次，每次5 min。5%脱脂奶粉37℃封闭1 h。加入p-p38 MAPK或HSP 70一抗（同免疫组化）或β-actin（Rabbit Aβ-actin，Boaosen，Cat no．：BS-0061R，lot no．：061204），4℃孵育过夜。次日取膜复温后，TTBS洗膜 3次，每次 5 min，加入二抗（羊抗兔 IgG，KPL，Cat no．：16-15-06，lot no．：030785），37℃孵育 1 h。TTBS洗膜 3次，每次 5 min，DAB显色。应用 Gel-Pro Analyzer Version 3．0凝胶成像分析系统分析所得条带的积分光密度（integrated optical density，IOD）值，用目的蛋白条带与βactin条带的IOD值的比值作为统计分析数据。

1．5 统计学处理

应用SPSS13．0软件进行统计分析，以均数±标准差（¯x±s）表示，单因素方差分析（one way ANOVA）进行组间比较，有显著差异者用最小显著差法（least significant difference，LSD）进行两两比较。

2 结果

免疫组化结果显示：p-p38 MAPK及HSP 70阳性表达产物均为棕黄色颗粒，分布于细胞的胞浆和胞核。sham组大鼠海马CA3区及DG区细胞中pp38 MAPK及HSP 70的表达较少（图1，2）。LIP后，海马CA3区及DG区p-p38 MAPK及HSP 70的表达呈现出动态的变化：其中p-p38 MAPK于LIP后1 d表达明显增多（图1A），所测阳性细胞的光密度和总面积与sham组相比均有显著性差异（P＜0．05）（图1B），LIP后3 d达到高峰，4 d后逐渐回落（图1A和B）；HSP 70的表达于LIP后2 d明显增多，3 d达到高峰，4 d后逐渐减少（图2A和B）。

Fig．1 Immunohistochemistry shows the time course of p-p38 MAPK expression in the rat CA3 and DGhippocampal fields after limb ischemic preconditioning（LIP）A：Immunohistochemical staining photomicrographs fromeach group（DABstaining，Scale bar：20μm）；B：Immunostaining with optical density and total area of the immuno-positive cells*P＜0．05 vs sham group

Fig．2 Immunohistochemistry shows the time course of HSP 70 expression in the rat CA3 and DGhippocampal fields after limb ischemic preconditioning（LIP）A：Immunohistochemical staining photomicrographs fromeach group（DABstaining，Scale bar：20μm）；B：Immunostaining with optical density and total area of the immuno-positive cells*P＜0．05 vs sham group

Western blot结果显示：与sham组相比，LIP后大鼠海马CA3区及DG区p-p38 MAPK及HSP 70的表达均增加，且二者的变化趋势与免疫组化的结果一致：p-p38 MAPK于LIP后1 d开始增多、LIP后3 d达到高峰；HSP70于LIP后2 d开始增多、LIP后3 d达到高峰（图3A和B）。

Fig．3 Western blot analysis shows the time course of p-p38 MAPK and HSP 70 expression in the rat CA3 and DG hippocampal fields after limb ischemic preconditioning（LIP）A：Immunoblot bands in the following groups：sham，6 h，12 h，1 d，2 d，3 d，4 d and 5 d of reperfusion following LIP．Five independent experiments yielded similar results；B：Immunoblots with integral optical density（IOD）．The ratio of the IOD of immunoblot of the protein of interest toβ-actin was used for statistical analysis*P＜0．05 vs sham group

3 讨论

虽然脑缺血的发生无法预测，但是在心脏及大血管围手术期或是心肺分流术等一些发生脑缺血危险几率较高的手术中，全脑缺血性损伤是可以预知的。如果能在损伤发生之前就施予干预措施、避免或是减轻缺血打击对大脑造成的损伤，无疑具有重要的现实意义。我室既往研究证实，肢体缺血预处理能诱导大鼠的脑缺血耐受，使海马CA1区在遭受缺血性打击后免受损伤，并且LIP的脑保护作用与NO［1］、p38 MAPK［2，3］、HSP 70［4］、c-fos［7］、ERK［8］、SOD［9］等的上调有关。

缺血时间的长短决定了海马各区神经元受损的程度。在我们的试验中，8 min全脑缺血／再灌注造成大鼠海马CA1区神经元发生延迟性死亡，而对CA3区及DG区的神经元无明显影响。我们已经证实，在大鼠海马CA1区，LIP通过上调p38 MAPK和HSP 70的表达发挥了部分脑保护作用［4］。但是，如果大脑面临更长时间的缺血打击，也必将使CA3区及DG区的神经元发生死亡，LIP能否能通过上调p38 MAPK和HSP 70的表达在上述区域也发挥脑保护作用尚未见报道。

我们在本实验中观察到，LIP能够明显上调大鼠海马CA3区及DG区p38 MAPK和HSP 70的表达，并且p-p38 MAPK上调的起始时间明显早于HSP 70表达上调的起始时间。既然LIP能通过上调p38 MAPK和HSP 70的表达诱导大鼠海马CA1区的缺血耐受［4］，提示 LIP上调的 p38 MAPK和 HSP 70也可能参与了CA3区和DG区的脑保护作用。如果摸索一个足以引起CA3区和DG区细胞死亡的缺血打击时间，并观察LIP及p38 MAPK和HSP 70在其中的作用，将为以上设想提供更为充实的实验证据。我们将在下一步的实验中解决上述问题。

海马分为CA1～CA4区，在大鼠不存在CA2区，CA4区有时指齿状回的多形层，有时指伸入齿状回的锥体细胞区，为避免混淆已基本不用。因而，大鼠的海马通常由CA1和CA3两个区组成，形状如大C字形，DG区像一反写的小C，与大C连接，构成S形状。CA1区、CA3区及DG区在脑组织内紧密相邻，因而在LIP后可能启动了相同的分子机制，即LIP通过上调了海马p38 MAPK和 HSP 70的表达发挥脑保护作用。

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