尼氟灭酸对γ-氨基丁酸激活DRG神经元电流的作用*

李 丽，李 静，马克涛，成洪聚，赵 磊，汪 洋，司军强△

（1．石河子大学医学院生理和病理生理教研室，2．新疆地方与民族高发病教育部重点实验室-电生理研究室，石河子832002）

γ-氨基丁酸（gamma aminobutyric acid，GABA）作为一种重要的中枢抑制性神经递质，广泛分布于哺乳动物的中枢神经系统，对神经元具有普遍的抑制性作用。GABA在抗焦虑、抗惊厥、镇痛和调节内分泌等方面发挥着重要作用［1］。GABAA受体是一超家族配体门控离子通道，目前已有至少19个受体亚单位被成功克隆，已鉴定的GABAA受体主要由α、β、γ和δ构成，其中除δ亚基外，每一种亚基均有不同的异构体存在（α1-α6、β1-β4和γ1-γ4），α6和γ2又各有两个剪接变异体。目前认为GABAA受体是由不同亚基构成的五聚体，被GABA激活后通过开启Cl-通道产生抑制作用，其效应可被荷包牡丹碱（bicuculline）阻断。GABAA受体本身作为通道-受体复合体还有多种药物的结合位点，这些药物结合位点与GABA识别位点在构像上相互作用，直接或间接参与Cl-通道的门控过程，发挥着加强或抑制GABA的药理学作用。一般认为GABAA受体包括氯通道和五个分别供 GABA、苯二氮类（benzodiazepine）、巴比妥类（barbiturates）、苦味毒（picrotoxin）和麻醉药的结合位点［2］，上述药物可通过与其相应的结合位点作用调节GABAA受体对GABA的反应。

非甾体类抗炎药物（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）是目前临床使用较为广泛的一类药物，其通过抑制环氧合酶和前列腺素的合成发挥解热、镇痛和抗炎作用［3］。已有文献报道，NSAIDs对中枢神经系统神经元GABAA受体功能也存在着重要的调节作用［4］，但NSAIDs对外周神经系统神经元GABAA受体有无调节作用研究甚少。本研究选择非甾体类的抗炎药物尼氟灭酸（niflumic acid，NFA），观察 NFA对外周背根神经节（dorsal root ganglia，DRG）神经元GABA激活电流的作用。

1 材料与方法

1．1 主要材料

实验所用动物由新疆医科大学医学实验动物养殖中心提供的4周龄 SD大鼠（200～250）g，雌雄不限，动物质量符合一级标准。葡萄糖酸钾、胶原酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制剂、荷包牡丹碱（bicuculline）、GABA、NFA、HEPES为 Sigma公司产品，其余试剂均为国产分析纯试剂。

1．2 主要仪器

Axon 700B放大器（美国Axon公司）、P-2000拉制仪（美国 Sutter公司）、生物电信号记录计算机（Axoscope 10．2软件，美国 Axon公司）。

1．3 细胞制备［5］

实验动物为4周龄的SD大鼠，击昏、断头后迅速切开背部皮肤沿脊柱两侧剪断与之相连的肋骨，取出胸腰段脊柱由脊柱正中剖开成两半置于O2饱和的细胞外液中，外液成分为（mmol／L）：NaCl 150；KCl 5；CaCl22．5；MgCl21；HEPES 10；D-glucose 10，pH 7．4，溶液渗透压为340 mOsm。由剖开的椎管内侧取出神经节及相连的神经前后根和脊神经，在显微镜下用角膜剪及游丝镊剪除相连的神经和结缔组织，将分离出的DRG剪碎转移至培养皿内，加胰蛋白酶 0．25 mg／ml，胶原酶 0．5 mg／ml后移于试管中，在37℃恒温温箱中孵育15 min。然后加入适量胰蛋白酶抑制剂终止胰蛋白酶的消化。将上述机械分离20℃～30℃和酶处理的DRG神经元离心（1 000 r／min，6 min），然后转移至培养皿内，室温20℃～30℃下静置至少30 min。

1．4 全细胞膜片钳记录［5］

使用Axon 700B放大器（美国Axon公司）进行实验记录，玻璃微电极用P-2000拉制仪（美国Sutter公司）拉制，电极阻抗约为1～5 MΩ，玻璃微电极所充内液成分为（mmol／L）：KCl 140；CaCl21；MgCl22；HEPES10；EGTA 11，细胞外液的成分为（mmol／L）：NaCl 150；KCl 5；CaCl22．5；MgCl21；HEPES 10；d-glucose 10，在电极与细胞膜形成高阻（1～5 GΩ）封接后将膜吸破然，然后调节电容和串联电阻补偿保持电压为负60 mV。膜电流应用低通滤波（10 Hz）。药物均采用无糖外液配制，pH 7．4。给药系通过微操纵器移动快速换液装置的排药管进行，排药管的每个管口的直径0．5 mm，管口距所记录的细胞100μm，实验在室温22℃～30℃范围进行。

1．5 统计学分析

采用SPSS17．0软件进行数据分析，实验数据采用均数±标准差（±s）表示，给药前后采用两均数的 t检验来分析数据。

2 结果

本实验所检测的大鼠新鲜分离DRG细胞呈圆形或椭圆形。实验选用的细胞轮廓清晰，折光性强，直径在20μm～45μm之间，静息电位为（-58±6．3）mV（n＝159）。其中部分细胞连有被离断的轴索突起残端，呈卷曲状。

2．1 GABA激活背根神经节神经元的内向电流

被测 DRG的神经元中有 94．32%（150／159）对外加 GABA（0．1～1 000μmol／L）敏感，GABA引起明显的内向电流，且具有明显的去敏感现象（图1），即虽然GABA持续存在且浓度不变，但GABA激活电流达到顶峰后，电流幅值立即呈指数衰减直到达到一稳定值。GABA激活内向电流的 EC50为（27．3±2．4）μmol／L（n＝7）。100μmol／L的 GABA引起的电流幅值为（1．29±0．72）nA（n＝53）。该电流可被GABAA受体特异性拮抗剂荷包牡丹碱（bicuculline，100μmol／L）几乎完全阻断 （n＝6）（图1），这一结果与我们实验室前期的研究结果一致［5］。

Fig．1 Effect of bicuculline（100μmol／L）on the GABAA receptor GABA：Gamma aminobutyric acid

2．2 尼氟灭酸激活背根神经节神经元的外向电流

被测DRG的神经元预加不同浓度NFA（0．1～100μmol／L）20 s，其中 43．75%（21／48）的 DRG神经元对外加NFA敏感，可见不同浓度的NFA可引起DRG神经元产生较小的外向电流，且具有浓度依赖性，但没有明显的去敏感现象（图2）。100μmol／L的NFA引起的电流幅值为（0．27±0．06）nA（n＝12）。

2．3 尼氟灭酸浓度依赖性的抑制GABA激活电流

DRG神经元全细胞膜片钳记录形成后，胞外给予100μmol／L GABA约5 s，记录GABA激活电流，外液冲洗4 min后再一次记录GABA激活电流作为前对照。预灌流不同浓度的NFA后，给予相应浓度NFA和GABA混合药物，发现预加NFA可降低GABA激活电流的幅值，NFA对GABA激活电流的抑制具有浓度依赖性，IC50为（27．19±4．87）μmol／L（n＝48）。0．1μmol／L的 NFA对 GABA激活电流幅值的抑制率为（0%±0．09%）（n＝4），与对照组相比差异无统计学意义（P＞0．05）；1μmol／L、3μmol／L、10μmol／L、30μmol／L、100μmol／L的 NFA均可抑制GABA激活电流幅值，NFA对GABA激活电流幅值的抑制率分别为（5．32%±3．51%）（n＝6）、（21．3%±4．00%）（n＝5）、（33．8% ±5．20%）（n＝17）、（58．2%±5．82%）（n＝4）、（63．9%±4．12%）（n＝12）（图3）。但 NFA没有改变GABA激活内向电流的 EC50值（26．9±2．7）μmol／L（n＝8），与不预灌流NFA相比，GABA激活内向电流的EC50差异无显著性（P＞0．05）。

2．4 尼氟灭酸对背根神经节神经元GABA激活电流翻转电位的作用

GABA激活内向电流的翻转电位约为（9．87±1．32）mV（n＝6），但在预灌流 100μmol／L的 NFA后，GABA激活的内向电流翻转电位为（9．64±1．24）mV（n＝4），与不预灌流 NFA相比，GABA激活的内向电流翻转电位差异无显著性（P＞0．05，图 4、5）。

Fig．2 Records of outward current induced by niflumic acid

Fig．3 Records of GABA-activated currents with pretreatment of niflumic acidNFA：Niflumic acid

Fig．4 Tracings of the inverse potential of GABA-activated currents with present and non-present niflumic acidGABA：Gamma aminobutyric acid；NFA：Niflumic acid

Fig．5 Inverse potential of GABA-activated currents with present and non-present niflumic acidGABA：Gamma aminobutyric acid；NFA：Niflumic acid

3 讨论

GABA是脊髓主要的抑制性神经递质，在初级感觉信息传递（尤其是伤害性感受）通路的控制中发挥重要作用。免疫细胞化学方法证明脊髓背角IIII层有大量GABA神经元，特别是Ⅱ层的大多数岛细胞是GABA能的，它们的轴突和含囊泡的树突与C纤维终末球复合体中的C末梢形成轴突-轴突型和树突-轴突型突触联系。这种突触前抑制的突触结构的存在，提示GABA能神经元参与对伤害性信息传递的突触前调制［5］。DRG神经元膜有GABAA及GABAB受体共存已经得到证实。脊髓GABA能中间抑制性神经元释放GABA作用于初级传入终末（DRG神经元中枢突末梢）的GABAA受体，增加DRG神经元 Cl-电导，导致 Cl-外流，产生去极化［6］。因此，当GABA作用于脊髓时，使Ⅱ层C初级传入末梢去极化，由于分流作用导致传入冲动幅度降低，减少递质释放，产生突触前抑制，使背角痛敏神经元的活动减弱，对初级感觉传入尤其是痛觉的上传起到抑制作用［7］。因此，研究DRG神经元GABAA受体的作用和被调节机制，对阐明初级感觉信息传入的突触前机制具有重要意义。

GABAA受体为配体门控通道受体，GABAA受体被GABA激活后，导致Cl-通道开放，然而通道开放后Cl-将内流还是外流取决于Cl-的平衡电位与静息电位的相对值。而在DRG和交感神经节神经元等外周神经系统，神经元膜上几乎没有钾-氯转运体的表达［8］，胞内 Cl-浓度大于胞外，细胞内 Cl-浓度较Nernst方程计算出来的数值为高，Cl-的平衡电位较静息电位为小（指绝对值），当GABA激活后开放Cl-通道时则产生Cl-外流（内向电流）使膜发生去极化。本实验中GABA可引起DRG神经元产生明显的内向电流，电流幅值约为（1．29±0．72）nA（n＝53），该电流具有明显的去敏感现象，并可被GABAA受体阻断剂bicuculine阻断，翻转电位在-10 mV左右都与以往的实验结果一致，表明GABAA受体激活开放了Cl-通道［5］。

已有大量的文献报道，NSAIDs对中枢神经系统神经元GABAA受体功能也存在着重要的调节作用［4］。GABAA受体作为配体门控离子通道能被很多药物调控，包括苯（并）二氮卓类、巴比妥类、类固醇、惊厥剂和麻醉剂［9］。已有报道，NFA对 GABAA和NMDA受体有调节作用［4］。甲芬那酸（一种非甾体抗炎药物）能直接作用于神经元膜的 GABAA受体［10］。NFA也可以作为正性变构调节剂作用于α1β2γ2组成的GABAA受体，另外，NFA也能作为负性变构调节剂作用于α6β2和α6β2γ2组成的 GABAA受体［9］。我们的研究表明，NFA没有改变GABA激活内相电流的 EC50（约为 30μmol／L）值，但明显使GABA激活电流最大值减少约60%，表明NFA对GABA激活电流的抑制作用使非竞争性的。但是NFA在背根神经节神经元是直接作用于GABAA受体亚单位的位点，还是通过细胞内第二信使途径磷酸化GABAA受体的亚单位发挥抑制作用还有待于进一步明确。

［1］ Bormann I．The‘ABC’of GABA receptors［J］．Trends Pharmacol Sci，2000，21（1）：16-19．

［2］ Wu J，Harata N，Akaike N．Роtentiation by sevoflurane of theγ-aminobutyric acid-induced chloride current in acutely dissociated CA1 pyramidal neurons from rat hippocampus1［J］．Br J Pharmacol，1996，119（5）：131-139．

［3］ Bruera E．Mechanism of action of nonsteroidal anti-inflammatory drugs［J］．Cancer Ivest，1998，16（7）：538-539．

［4］ Babot Z，Cristofòl R，Suйol C．Excitotoxic death induced by released glutamate in depolarized primary cultures of mouse cerebellar granule cells is dependent on GABAA receptors and niflumic acid-sensitive chloride channels［J］．Eur J Neurosci，2005，21（1）：103-112．

［5］ Si JQ，Zhang ZQ，Li CX，et al．Modulatory Effect of Substance P on GABA-activated currents from rat dorsal root ganglion［J］．Acta Pharmacol Sin，2004，25（5）：623-629．

［6］ Alvarez F J，Kavookjian A M，Light A R．Synaptic interactions between GABA-immunoreactive profiles and the terminals of functionally defined myelinated nociceptors in the monkey and cat spinal cord［J］．J Neurosci，1992，12（8）：2901-2917．

［7］ Sivilotti L，Nistri A．GABA receptor mechanisms in the central nervous system［J］．Prog Neurobiol，1991，36（1）：35-92．

［8］ AndréS，Boukhaddaoui H，Campo B，et al．Axotomy-induced expression of calcium-activated chloride current in subpopulations of mouse dorsal root ganglion neurons［J］．JNeurophysiol，2003，90（6）：3764-3773．

［9］ Mehta A K，Ticku MK．An update on GABAA receptors［J］．Brain Res Brain Res Rev，1999，29（2-3）：196-217．

［10］ Coyne L，Su J，Patten D，et al．Characterization of the interaction between fenamates and hippocampal neuron GABA（A）receptors［J］．Neurochem Int，2007，51（6-7）：440-446．