卤鸡腿废弃液酶解工艺优化及其抗氧化活性研究

李 燕 徐 静 吴祥庭 季燕珍

（1．温州科技职业学院，浙江 温州 325006；2．温州大学生命与环境科学学院，浙江 温州 325000）

在卤制品加工的蒸煮取肉过程中，会产生大量的卤制加工的预煮废弃液。这些废弃液中含有较多的营养物质，经本实验室检测，其中蛋白质含量约为1．54g／100mL、脂肪含量约为1．0g／100mL、氨基酸含量约为0．06g／100mL。目前很多企业采用生化方法处理废弃液，但是生化处理需要大量的人力和一定处理成本；也有些企业将废弃液直接排放到环境中，这不仅造成资源的极大浪费，而且对环境也产生了不良影响［1］。

目前有关卤制加工废弃液开发利用的研究很少。本课题组［1，2］曾采用陶瓷膜对卤制加工废弃液进行微滤，再用纳滤膜进行浓缩，得到浓缩液。本研究以此为基础，以所得浓缩废弃液为原料，利用单因素和Box－Behnken中心组合试验设计对其酶解工艺进行优化，并对酶解液的抗氧化活性进行研究，为深度开发卤制加工废弃液制品提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 主要材料及仪器

卤鸡腿预煮废弃液：浙江省温州市东瓯食品有限公司，－20 ℃贮藏；

动物蛋白水解酶：酶活力60万U／g，广西南宁庞博生物工程有限公司；

其他试剂：均为中国产分析纯。

实验室小型陶瓷膜和多功能膜：LNG－CM－101型，上海朗极化工科技有限公司；

自动凯氏定氮仪：K－370型，瑞士BUCHI有限公司；

日立氨基酸分析仪：L－8800型，日本日立公司；

紫外可见分光光度计：752S型，上海凌光技术有限公司；

酸度计：DELTA320型，梅特勒－托利多国际股份有限公司；

数显恒温水浴锅：HH－2型，国华电器有限公司。

1．2 试验方法

1．2．1 陶瓷膜微滤卤鸡腿预煮废弃液 取一定量卤鸡腿预煮废弃液，用300目网筛过滤，然后用孔径0．22μm 陶瓷膜，在温度50℃、操作压力0．075MPa条件下过滤，去除废弃液中的杂质以及大分子物质，以减少对纳滤膜的污染［1］。

1．2．2 纳滤膜浓缩卤鸡腿预煮废弃液 微滤液再选用360Da的纳滤膜，在操作压力为1．5 MPa，操作温度为40 ℃，pH 为6．0条件下，通过纳滤膜浓缩废弃液［2］。

1．2．3 卤鸡腿纳滤浓缩液酶解单因素试验 以水解度为评价指标，分别研究酶解时间、加酶量、初始pH 值、酶解温度对酶解效果的影响，每组试验重复3 次，结果取平均值。

（1）酶解时间：在酶解温度50 ℃、初始pH 7．0、蛋白酶加酶量0．8%条件下，研究酶解时间对水解度的影响。

（2）加酶量：在酶解温度50 ℃、初始pH 7．0、酶解时间6h条件下，研究蛋白酶加酶量对水解度的影响。

（3）初始pH 值：在酶解温度50 ℃、酶解时间6h、蛋白酶加酶量1．0%条件下，研究初始pH 对水解度的影响。

（4）酶解温度：在酶解时间6h、蛋白酶加酶量1．0%、初始pH 7．0条件下，研究酶解温度对水解度的影响

1．2．4 响应面法优化酶解条件 在单因素试验的基础上，选取对水解度影响较大的因素为自变量，根据Box－Behnken中心组合试验设计原理［3，4］，以蛋白水解度为响应值，设计响应面试验，以进一步优化酶解工艺条件。

1．2．5 氨基酸态氮的测定 参照GB／T 5009．39－2003，采用甲醛滴定法。

1．2．6 总氮的测定 参照GB／T 5009．5－2010，采用半微量凯氏定氮法。

1．2．7 水解度（DH）的测定 水解度指水解断裂的肽键数占总肽键数的百分比。水解断裂的肽键数可通过水解放出的氨基氮数目来测定［5］。按式（1）计算水解度。

1．2．8 酶解液抗氧化活性的测定

（1）酶解液的还原能力［6］：取2．5mL不同浓度酶解液，加入2．5 mL 0．2 mol／L 的 磷 酸 钠 缓 冲 液（pH 6．6）和2．5mL 1%的K3［Fe（CN）6］溶液，混匀，50 ℃水浴20 min，加入2．5mL 10%的三氯乙酸，3 000r／min离心10 min，取5mL 上清液加去离子水5mL、0．1%的FeCl3溶液1mL，于700nm 处测定吸光度值。并用BHT 和VC作对照试验。

（2）酶解液对DPPH 清除力的测定［7］：取2 mL 样品溶液，加入等体积0．8 mmol／mL 的DPPH 醇溶液，混匀后静置30min，于517nm 处测定吸光度值。并用BHT 和VC作对照试验。按式（2）计算DPPH 清除率。

式中：

R——DPPH 清除率，%；

Ax—— 加入样品溶液后的吸光度；

Ax0—— 样品溶液本底的吸光度；

A0—— 空白对照液的吸光度。

1．3 数据分析

采用Design－Expert 6．0．5Trial软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与讨论

2．1 卤制加工废弃液的膜分离浓缩

卤制加工废弃液膜分离浓缩前后蛋白质、游离氨基酸浓度的变化见表1。由表1可知，经纳滤膜浓缩后，卤制加工废弃液的蛋白质浓度为8．43g／100 mL，游离氨基酸浓度为0．25g／100mL。后续试验以浓缩后的卤制加工废弃液进行酶解试验。

表1 膜分离浓缩后废弃液各成分变化及浓缩倍数Table1 Components and concentration times of membrane separation and concentration

2．2 浓缩废弃液酶解条件优化

2．2．1 酶解时间对水解度的影响 由图1可知，水解度随酶解时间的延长而增大，并趋于一个稳定值；而水解速率于反应起始阶段增加较快，随后下降，6h后水解速率的增加明显下降。考虑到生产成本及对产品品质的影响，后续试验的酶解时间控制为6h。

2．2．2 加酶量对水解度的影响 由图2可知，随着加酶量的增加，酶对蛋白水解作用增强，水解度呈不断上升的趋势，体系水解度和水解速率均随初始酶浓度的增加而增强，但当加酶量超过1．0%时，酶分子趋向饱和，继续增大加酶量其影响不大，水解度上升趋势变化缓慢。因此，加酶量控制在1．0%左右较为适宜。

2．2．3 初始pH 值对水解度的影响 初始pH 值会影响酶的稳定性，从而影响酶解反应。由图3 可知，随着初始pH值的增加，水解度也在增加，但是在初始pH 值为7．0之后，水解度呈下降趋势。这是由于酶有最适pH 值，若偏离最适pH 值，即改变溶液中OH－浓度，会影响蛋白酶自身的解离和底物的解离，从而影响酶解反应，使得酶的反应速率受到抑制，酶解不充分［8］。因此，初始pH 值控制在7．0左右较为适宜。

图1 酶解时间对水解度的影响Figure1 Effect of different time on the hydrolysis degree

图2 加酶量对水解度的影响Figure2 Effect of enzyme ammount on hydrolysis degree

图3 初始pH 值对水解度的影响Figure3 Effect of pH on the hydrolysis degree

图4 酶解温度对水解率的影响Figure4 Effect of temperature on the hydrolysis degree

表2 因素水平表Table2 Factors and levels of response surface methodology（RSM）

表3 Box－Bchnken设计方案和试验结果Table3 Program and experimental results of Box－Bchnken

2．2．4 酶解温度对水解度的影响 由图4可知，在一定的范围内，水解度随着温度的上升而不断增加，但是超过60 ℃之后，水解度趋于缓慢增长且有下降的趋势。其原因是温度升高，反应速度加快，但温度过高会导致酶蛋白变性，酶的稳定性也会下降，酶解效率也随之降低。因此，酶解温度控制在60 ℃左右较为适宜。

2．2．5 卤鸡腿废弃浓缩液酶解的响应面试验分析 在单因素试验的基础上，以酶解温度、初始pH 值、加酶量3个因素为自变量，以蛋白水解度为响应值，设计三因素三水平的试验。试验因素的水平取值见表2，试验设计及结果见表3。

利用Design－Expert 6．0．5Trial软件对表3试验数据进行多元回归拟合，得到动物蛋白酶水解卤鸡腿废弃浓缩液的回归方程：

由表4可知，酶解温度、初始pH 值和加酶量对水解度的影响显著，三者之间交互作用也显著。所选用的二次多项模型具有高度的显著性（P＜0．000 1）。失拟项在0．05水平上不显著（P＝0．055 8＞0．05），其决定系数为0．998 6，校正决定系数为0．996 8，说明该模型能解释99．68%。响应值的变化，仅有总变异的0．32%不能用此模型来解释，说明该模型拟合程度较好，用该模型对卤鸡腿废弃浓缩液酶解工艺研究进行优化是合适的。

表4 试验结果方差分析表Table4 Variance analysis of ACE－inhibitory activity experiment

图5 酶解温度和初始pH 值对水解度影响的曲面图及等高线图Figure5 Response surface plot and contour map showing the effect of temperature and pH on hydrolysis degree

由图5～7可知，酶解温度与初始pH 值的交互作用对水解度的影响最大，初始pH 值和加酶量次之，酶解温度和加酶量再次之。

2．2．6 验证实验 根据上述响应面优化试验结果和二次多项回归方程，利用Design－Expert 6．0．5Trial软件获得了各个因素的最佳水解条件组合为酶解温度59．74 ℃、初始pH值6．94、加酶量1．14%、酶解时间6h，在此水解条件下，水解度预测值为32．15%。为便于操作将最优工艺组合修正为酶解温度60℃、初始pH 值7、加酶量1．14%、酶解时间6h，以此工艺组合进行3 次验证实验，其实测得水解度为32．07%±0．47%，与理论预测值的误差在±1%以内，说明采用响应面优化得到的酶解工艺参数准确可靠，具有实用价值。

2．3 酶解液的抗氧化活性

2．3．1 酶解液的还原能力 以BHT 和VC为对照测定了酶解液的总还原力。由图8可知，在40μg／mL时，酶解液的还原能力最强，吸光度值为2．27；之后，随着酶解液浓度的增大，其还原能力稍有下降。在试验浓度范围内，酶解液的还原能力均优于BHT 和VC，说明酶解液具有较强的还原能力，将其应用于调味基料的制作，可提高调味料的抗氧化性。

2．3．2 酶解液对DPPH 清除作用 由图9可知，在试验浓度范围的酶解液对DPPH 清除率较大，均在80%以上，当酶解液浓度为40μg／mL时，对DPPH 清除率最大，达到90%。在酶解液浓度小于60μg／mL时，酶解液对DPPH 的清除率明显高于BHT 和VC；浓度大于60μg／mL 后，酶解液与BHT、VC对DPPH 清除效果的清除效果相差不大。说明酶解液具有较强的清除DPPH 自由基的能力。

图6 酶解温度与加酶量对水解度影响的曲面图及等高线图Figure6 Response surface plot and contour map showing the effect of temperature and enzyme amount on hydrolysis degree

图7 初始pH 值与加酶量对水解度影响的曲面图及等高线图Figure7 Response surface plot and contour map showing the effect of pH and enzyme amount on hydrolysis degree

图8 不同浓度酶解液、BHT 和VC 的还原能力比较Figure8 Comparison of reducing power between different concentration of enzymatic hydrolysate，BHT and VC

图9 不同浓度酶解液、BHT 和VC 对DPPH 的清除率Figure9 Scavenging ability of different concentration enzymatic hydrolysate BHT and VCon DPPH scavvenging rate

3 结论

本试验采用陶瓷膜对卤鸡腿废弃液进行分离、纳滤膜浓缩，重点探讨了卤鸡腿废弃浓缩液的酶解工艺条件，并对其抗氧化活性进行研究。结果表明，其最佳酶解工艺为酶解温度60 ℃、初始pH 值7、加酶量1．14%、酶解时间6h，该条件下酶解液的水解度为32．07%±0．47%；酶解液具有较强的铁还原能力和清除DPPH 自由基能力，是一种良好的抗氧化物质。按本试验的方法制备的卤鸡腿废弃浓缩液的酶解液可为新型天然调味料的开发提供基料，这既丰富了调味品市场，又为卤制加工预煮废弃液的回收利用提供了新的途径。但关于卤鸡腿废弃浓缩液的酶解液中的主要抗氧化成分还有待进一步的研究。

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