枸杞多糖的化学分析与降血糖作用研究进展

唐华丽孙桂菊陈 忱

TANG Hua－li1，2SUN Gui－ju2CHEN Chen2

（1.重庆三峡学院生命科学与工程学院，重庆 万州 404000；2.东南大学公共卫生学院，江苏 南京 210009）

糖尿病是严重影响人类健康的非传染性疾病之一。据世界卫生组织（WHO）估算［1］，目前全球约有1.8亿糖尿病患者，其中中国为3 000万人。而到2030年糖尿病患者的数量将会成倍的增加，中国的糖尿病患者总数将接近1亿人，是临床亟待解决的问题之一。研究［2］证明，长期使用常见的临床降糖药，效果不佳，且有较严重的副作用，因此世界各国医务工作者和研究人员纷纷致力于从天然药物中筛选和研究降糖药物。

枸杞子为中国国家公布的药食同源品种之一，具有独特的营养和药用价值［3，4］。其中枸杞多糖 （Lyciumbarbarumpolysaccharides，LBP）作为枸杞发挥功效的重要活性成分而成为近年来一个研究的热点。枸杞多糖能够降低动物及Ⅱ型糖尿病患者空腹和餐后血糖的作用已被证实，但是关于枸杞多糖是如何进入体内，代谢生成何种物质，代谢组分如何发挥功效作用等问题尚不清楚。文章就近年来国内外在枸杞多糖化学分析和降血糖作用方面的研究进行综述，旨在为枸杞多糖的吸收、代谢以及降血糖机制等研究提供参考。

1 枸杞多糖的化学分析

1.1 枸杞多糖的纯度鉴定

枸杞多糖的生物学活性与其相对分子质量有很大关系，因此在对枸杞多糖生理功能及其作用机制的深入研究中，相对分子质量是一个重要指标。要测定枸杞多糖的相对分子质量，首先要求鉴定其纯度。多糖的纯度标准不能用一般化合物的纯度标准来衡量，因为即便是多糖纯品，其微观结构也是不均一的，它实际上是一定相对分子质量范围内的多糖的均一组分，它的纯度只能代表相似链长的多糖分子的平均分布。国内外对枸杞多糖纯度鉴定的方法有比旋度法、层析法、超离心法、电泳法、色谱法、示差折射法、紫外检测法等［5］。在实际应用中，一般至少需要两种方法同时对样品进行纯度验证。王建华［6］对纯化后的枸杞多糖亚组分同时采用Sephadex G－200和SDS－PAGE进行纯度验证，结果均表明枸杞多糖各亚组分分子量分布均一。张民等［7］同时采用琼脂糖凝胶电泳法及高效液相色谱法（HPLC）对经DEAE纤维素和Sephadex G－75色谱柱纯化后的枸杞多糖组分进行纯度验证，结果均表明LBP－4a和LBP－5b都是均一的多糖组分。朱彩平等［8］采用琼脂糖凝胶电泳和纸色谱的方法验证经Sephadex G－75纯化后收集的多糖组分为单一组分。近年来，高效凝胶渗透色谱（HPGPC）结合示差检测器检测的方法［9－13］。由于其省时、准确度高等优点而被广泛应用于多糖的纯度测定中，多糖组分经凝胶色谱得到一对称峰，通过面积归一化法计算不同相对分子质量多糖的组成。

1.2 枸杞多糖含量的测定

目前枸杞多糖含量测定最常用的方法是苯酚—硫酸法［14－17］和蒽酮—硫酸法［18，19］，其原理是多糖在强酸作用下首先水解为单糖，然后迅速脱水生成糠醛或糠醛衍生物，糠醛物质与酚类或胺类化合物缩合，生成有特殊颜色的物质，利用有色物质在特定波长下的吸收强度来计算枸杞多糖的含量。但同时这两种方法在测定枸杞多糖含量方面还存在争议，其一是因为多糖本身并不是由某一特定单糖组分构成，且枸杞多糖为一种蛋白多糖，以葡萄糖为标准物参照不合理；其次枸杞多糖的纯化很难完全排除单糖等杂质组分的干扰。此外，也有人［20－23］将比旋度法、示差折射法、紫外检测和硫酸—咔唑法等应用于多糖的成分检测。

1.3 枸杞多糖相对分子质量的测定

多糖的生理活性通常与其相对分子质量（Mr）有关，因此测定枸杞多糖的Mr是深入研究其构效关系及作用机制的重要工作。多糖的Mr只能代表相似链长的平均分布，有数均相对分子质量（Mn）、重均相对分子质量（Mw）和粘均相对分子质量（Mv）3种表示方法，文献资料通常使用Mw表示多糖的Mr。过去用于测定多糖Mr的方法主要有：超速离心沉降法、渗透压法、蒸汽压法、端基法、光散射法、黏度法、凝固点下降法等［5］，可根据待测多糖的分子量范围选择测定。目前常用于枸杞多糖Mr测定的方法主要有：凝胶渗透色谱 法［9，24，25］和高效 液 相 色 谱 法［7，13，26］，这 两 种 方 法 均 要 以已知Mr的标准系列右旋糖酐（dextran）作对照来测定枸杞多糖的Mr。为了避免标曲制作时试验步骤繁琐以及试验误差，周鹏等［26］采用高效液相色谱与质谱联用（HPLCMS）的方法对茶多糖蛋白进行分子量测定，王战勇等［9］采用凝胶渗透色谱和激光光散射联用仪（GPC－LLS）测定枸杞多糖的Mr，既不需使用多糖标准品又取得了理想的试验效果。

1.4 枸杞多糖的分析方法及结构描述

1.4.1 枸杞多糖结构分析方法 同样是生物大分子，多糖的结构远比蛋白质和核酸复杂，沿用蛋白质结构的分类方法将多糖分为一、二、三、四级结构［27］，其中一级结构为初级结构，包括糖基的组成、糖基排列顺序、相邻糖基的连接方式、异头碳构型以及糖链有无分支、取代位置、官能团类型和含量等。二、三、四级结构为高级结构，是指多糖链在以氢键和非共价键为主的作用下连接而成的空间构象。糖链结构的微观不均一性，使糖链的一级结构测定工作更加复杂化，所以目前对枸杞多糖结构的研究多限于其一级结构的分析，主要有化学分析法、仪器分析法、生物学方法以及它们之间联用的方法，主要结构分析方法见表1。

表1 多糖结构分析方法Table1 The structure analysis method of polysaccharide

1.4.2 枸杞多糖的结构描述 研究枸杞多糖的结构对其发挥生理功能的作用机制的深入研究，以及更好的利用和开发枸杞多糖具有重要意义。由于组成枸杞多糖的单糖种类和数目等的不同，其结构非常复杂，目前，国内外对枸杞多糖的结构研究主要集中在其分子量测定、单糖组成及比例、糖环形式（吡喃环或呋喃环）、单糖残基类型及糖苷键连接位点、糖苷取代的异头异构形式（α－或β－）等初级结构的表达上。赵春久等［36］采用DEAE柱层析法从枸杞多糖中分离得到4个水溶性多糖均一体，除LBPC4的分子量1.0×104，为α－（1→4）（1→6）连接的葡聚糖肽外，LBPC3、LBPC2、LBPC1分别为分子量6.6×104、1.2×104、0.8×104，β－（1→4）（1→6）连接的杂多醣肽。田庚元等［37］早期研究从枸杞子中分离纯化得到一种糖蛋白LbGP，经电泳法测定分子量为88kD，该糖蛋白含量为70%，蛋白质含量30%，检测出16种氨基酸，单糖组成为Arb∶Gal∶Glu＝25∶10∶1，为Glycan－O－Ser链接的糖蛋白。郭琦等［38］将纯化得到的枸杞多糖组分LBP3－I进行结构和组成分析，红外光谱表明LBP3－I具有明显的糖类物质特征吸收峰且含有吡喃环，扫描电镜观察得知LBP3－I主要呈链状伴随着高度分支结构，且糖链间多相互缠绕聚集成环状，气相色谱分析得出其单糖组成分别为鼠李糖基、阿拉伯糖基、木糖基、甘露糖基、葡萄糖基和半乳糖基，且摩尔比率为2.07∶2.38∶3.11∶1.00∶1.12∶2.86，是一种含有结合蛋白的多糖复合物，和田庚元的研究结论相符。Zou等［39］将经DEAE离子交换纯化得到的LBP－1进行 HPLC和GC分析，得出LBP－1由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖和半乳糖醛酸残基组成，摩尔比为1.00∶7.85∶0.37∶0.65∶3.01∶8.16，对 LBP－1进行 FT－IR、GCMS、1H－NMR和13C－NMR分析，研究结果表明：各单糖的连接顺序依次为（1→5）－α－D－阿拉伯糖－（1→4）－α－D－半乳糖醛酸，通过－（3→6）－连接－（1）－甘露糖分支，链终端连接－（1）－甘露糖。目前对枸杞多糖的结构鉴定与描述均建立在：对枸杞多糖进行分离纯化得到各种分子量均一的多糖组分，然后选取相对含量较多的组分按表1的方法进行分析，按照单糖的组成和糖苷键连接顺序对组分多糖进行结构描述。随着分析分离技术的发展，糖链结构分析工作进展迅速，趋向于用少量样品（几十微克到几毫克）在较短时间内（几星期内）就能得到糖链结构的大部分或几乎全部信息。相比之下，目前对化学和仪器分析方面的技术方法研究较多，生物学方面的方法研究还比较薄弱。

2 枸杞多糖的降血糖作用

大量研究表明枸杞及其多糖具有降低血糖功能，可能是通过改善胰岛细胞形态功能、修复受损胰岛细胞和促进胰岛细胞再生，从而达到降低血糖水平的作用。Zou等［39］研究了枸杞多糖LBP－1对大鼠胰岛细胞RINm5F和人体肝细胞HepG2的体外降血糖试验，结果表明：LBP－1具有保护胰岛细胞免受氧化损伤、显著提高细胞存活率以及减轻HepG2的胰岛素抵抗作用，对开发降血糖功能食品和药物具有重要参考价值。赵蕊等［40，41］分别给予Ⅱ型糖尿病小鼠枸杞多糖高（40mg／kg·BW）、低（20mg／kg·BW）2个剂量水平，考查枸杞多糖对Ⅱ型糖尿病小鼠胰岛细胞形态和功能的影响，给药中期和后期高、低剂量组血糖浓度与模型组比较有显著性差异（P＜0.05），并呈现出一定剂量－效应关系，图像分析结果表明枸杞多糖可以改善Ⅱ型糖尿病小鼠胰岛细胞形态和功能并促进胰岛素的分泌，有良好的降血糖作用。王玲等［42］对四氧嘧啶诱导制备的糖尿病小鼠模型预防性灌胃LBP－D，观察枸杞多糖LBP－D对带病小鼠和正常小鼠的血糖水平，结果发现：在注射四氧嘧啶前4，1h，用LBP－D灌胃给药可使小鼠血糖浓度从对照组的21.3mmol／L降至注射四氧嘧啶后72h的10.2mmol／L，表明LBP－D有明显预防血糖升高作用。罗琼等［43］研究表明：经过提纯的枸杞多糖组分LBP－X对四氧化嘧啶糖尿病兔的降血糖效果优于粗枸杞多糖，更优于枸杞原汁，降糖效率达100%。孙桂菊等［44］研究了枸杞多糖和茶叶多糖（TPS）混合物对Ⅱ型糖尿病大鼠的控制效果，按照高（0.6g／kg·BW）、低（0.3g／kg·BW）2个剂量水平灌胃大鼠，对给药后高、低剂量组与正常组血糖值进行比较，结果表明：枸杞多糖、TPS混合物具有增加胰岛素敏感性和肝糖原储备，降低血糖水平的作用，对正常动物血糖水平和糖耐量未见影响；该研究组［45］还研究了枸杞多糖对Ⅱ型糖尿病大鼠血清糖基化终产物－肽（AGEs－P）、糖基化血红蛋白（HbAlc）等指标的影响，结果表明：枸杞多糖能降低Ⅱ型糖尿病大鼠血浆HbAlc、血清AGEs－P及肾脏IL－8的含量，从而起到预防糖尿病的作用。刘磊等［46］应用枸杞多糖灌胃以四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠，探讨了枸杞多糖对糖尿病小鼠的降糖作用和对胰岛B细胞的保护作用，结果发现4周后血清胰岛素（Ins）水平较治疗前显著上升，说明枸杞多糖确实改善了B细胞功能从而促进了Ins的分泌。

枸杞多糖还可能通过提高机体SOD等抗氧化剂的活力，降低机体MDA的含量，增强机体抗氧化能力及清除氧化产物的能力，减轻或阻止自由基对胰岛β－细胞的损伤、促进胰岛β－细胞的修复与再生来实现其降血糖作用［47］。汪建红等［48］通过给试验小鼠灌胃高（80mg／kg·BW）、中（50mg／kg·BW）、低（20mg／kg·BW）剂量的黑果枸杞果实多糖研究其降血糖功效及其机制，21d后测定试验小鼠血清与肝脏的超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量和肝糖原水平等指标。结果发现：黑果枸杞果实多糖对降低糖尿病小鼠血糖含量，增强血清和肝脏SOD活性，降低血清和肝脏MDA含量和促进葡萄糖转变为肝糖原方面具有显著的效果。陈晓琴等［49］比较了枸杞多糖与抗糖药物盐酸二甲双胍的降血糖作用及抗氧化能力，研究发现：和盐酸二甲双胍相比，枸杞多糖抗氧化能力较强而降血糖作用稍弱。低剂量组小鼠的血清SOD活力有显著提高（P＜0.05），高剂量组血清MDA则极显著降低（P＜0.01）。

此外，李朝晖等的细胞试验［50］表明，枸杞多糖具有较好的体外降血糖作用。Luo等［51］比较了枸杞果实浸出液、粗枸杞多糖和经纯化的枸杞多糖组分LBP－X对血糖的调节作用，试验取等量3种物质灌胃制备好的糖尿病兔子模型，连续灌胃10d后测定血糖浓度，结果显示枸杞浸出液、粗枸杞多糖和LBP－X均呈现良好的降血糖效果，其中LBP－X的降血糖作用比枸杞浸出液和粗枸杞多糖更为显著。

3 展望

枸杞子中的多糖成分具有许多重要生理功能且无毒副作用，因此在临床应用和功能食品开发方面具有广阔的应用前景，备受国内外研究者的青睐，但是由于枸杞多糖结构复杂、纯化后各组分样品量小、分析成本较高等难点限制了对其更深入的研究。现有枸杞多糖的研究成果主要集中在提取、分离纯化条件的优化、初级结构的表征分析以及发挥药效的推测方面。当前对枸杞多糖的研究需从以下几个方面展开：① 进一步探索并建立系统的绿色环保、低廉高效的提取纯化方法；② 强化枸杞多糖低级结构的表征分析，建立系统可靠的研究手段和表达方法；探索枸杞多糖高级结构的表征和描述，进而研究枸杞多糖结构、溶液行为与活性、功效之间的关系；③ 研究枸杞多糖发挥生理功效的作用机理，利用动物试验探索枸杞多糖在体内的降解途径以及以何种形式、在何部位发挥其功能作用；④ 加快开发以枸杞多糖为主要成分的药品和功能性食品。

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