豌豆发酵液中抗褐变成分的初步研究

周 丽 谷 云 王清章 汤少华 刘 松 李 洁 严守雷

(华中农业大学食品科技学院，武汉 430070)

酶促褐变是果蔬采后贮藏加工过程中引起营养价值、外观品质等降低的主要原因之一，直接导致巨大的经济损失。果蔬加工过程中，其内部的多酚类物质在多酚氧化酶(PPO)的催化下氧化生成醌类化合物，该化合物进一步聚合形成复杂的黑色聚合物，从而导致果蔬制品的褐变[1]。酶促褐变需要3个条件，它们是酶、底物和受氢体氧。控制3个条件中的任意一个因素或几个因素便能够达到控制果蔬酶促褐变发生的目的。在加工等生产实践中，底物和氧一般不容易除去。在这种情况下抑制导致酶促褐变的多酚氧化酶的活性成为加工过程中控制酶促褐变的极其重要的方法[2]。抑制果蔬酶促褐变的化学方法主要是用褐变抑制剂进行处理，常用的抑制剂有:亚硫酸盐、抗坏血酸、半胱氨酸、柠檬酸等[3]。近年来，随着人们对食品安全的重视，合成的食品添加剂越来越受到市场的限制，消费者对用天然物质代替合成化学物质作为食品添加成分的呼声越来越高[4－5]。近年来，人们在开发安全有效的天然抗褐变抑制剂方面做出了很多努力，比如:蜂蜜、洋葱提取液、石榴籽提取液、柿子叶提取液等等[6－7]。

马铃薯(Solanum tuberosum)，是茄科茄属多年生块茎草本植物。它具有很高的营养价值、保健功能，素有“地下苹果”和“第二面包”之称[8]。马铃薯是粮食和蔬菜兼用作物之一，其在加工、运输和销售过程中极易发生褐变，因此，以马铃薯作为抗褐变研究的对象具有典型意义。徐涵等[9]研究了豌豆发酵液对马铃薯浆液的抗褐变作用，发现豌豆酸浆具有显著的抗褐变效果，但其抑制褐变的成分和机理尚未报道。本试验对豌豆发酵液的化学成分进行了分析，并通以其对马铃薯PPO的抑制效果作为评价指标对其抗褐变成分进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马铃薯、豌豆:华中农业大学菜市场。

蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶:阿拉丁试剂公司。

邻苯二酚、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、抗坏血酸、L－半胱氨酸、EDTA －Na2、柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等试剂:均为分析纯，国药上海试剂公司。

透析袋:美国光谱医学。

722N型可见光分光光度计:上海光谱仪器有限公司；高速冷冻离心机:美国Backman公司；生化培养箱:上海一恒仪器有限公司；恒温水浴锅:北京东方精瑞科技公司；AL204分析天平:海梅特勒—托斯多仪器有限公司；豆浆机:日本松下电器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 豌豆发酵液的制备

参照徐涵等[9]的方法并加以改进，豌豆用清水浸泡24 h，加8倍水匀浆、过滤、沉淀，将滤液装入三角瓶密封，在恒温培养箱中(20℃)自然发酵72 h，即得豌豆发酵液，取上清液在12 000×g离心20 min后备用。豌豆发酵液的浓度以最终溶液中干豌豆的质量浓度计，单位为mg/mL。

1.2.2 马铃薯多酚氧化酶(PPO)的提取

马铃薯多酚氧化酶的提取参照Sun等[10]的方法并略作修改，马铃薯遇冷去皮，加入含有 0.1 mol/L磷酸钠缓冲液(pH 6.8)、1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、1%TritonX－100的提取液，料液比1∶2，冰浴研磨匀浆，抽滤后滤液于12 000×g离心 15 min。上清液用30%～80%的饱和硫酸铵盐析，12 000×g离心15 min，收集沉淀，将沉淀溶于少量0.01 mol/L磷酸钠缓冲液中(pH 6.8)，用同样的缓冲液透析过夜，得到PPO粗提液，于4℃保存备用。

1.2.3 不同抑制剂对马铃薯PPO抑制率的测定

将一定浓度的亚硫酸氢钠、抗坏血酸、柠檬酸、EDTA－Na2、未发酵豌豆液和豌豆发酵液分别与马铃薯多酚氧化酶混合并进行酶活测定。测定方法参照Lee等[11]的方法略作修改，取 1mL pH 6.8的0.01mol/L磷酸钠缓冲液加入1 mL抑制剂和0.1 mL PPO粗酶液在37℃保温3 min后，加0.9 mL 20 mmol/L邻苯二酚(用 0.01 mol/L，pH 6.8磷酸钠缓冲液配制)迅速混匀，立刻测定 OD410值的变化，以每分钟ΔOD410变化0.001表示一个酶活力单位。以未加抑制剂的处理作为空白，PPO抑制率计算如下式:

1.2.4 化学成分预试

按照植物化学成分系统分析的常规方法，直接对豌豆发酵液和未发酵的豌豆液检测以及采用正丁醇、石油醚等极性不同的溶剂分别对发酵液进行萃取，制成相应的供试液，并采用试管法和圆形滤纸层析法进行系统预试验[12－13]

1.2.5 热处理对发酵液抗褐变活性的影响

将豌豆发酵液分别经40、60、80、100、121℃处理30 min和60 min，冷却后10 000×g离心 15 min，取上清液测定其对PPO酶活的抑制效果。以经孔径为0.22μm的微孔滤膜过滤的样品为对照。每处理重复3次。

1.2.6 pH对发酵液抗褐变活性的影响

将豌豆发酵液的 pH分别调至 2、4、6、8、10、12后静置30 min，再将各处理组的pH调回初始发酵液的pH，分别测定各处理组对PPO酶活的抑制效果，以未经酸碱调节的豌豆发酵液作为对照。每处理重复3次。

1.2.7 发酵液中马铃薯抗褐变成分的分子质量预估

采用4种规格的透析袋:8 000 u、3 500 u、1 000 u、500 u。分别取10 mL豌豆发酵液置于透析袋内，在4℃条件下，用蒸馏水透析24 h，每6～8 h更换1次水，收集合并所有更换下来的水，真空减压浓缩至10 mL，称为渗出液。取出透析袋内的发酵液分别补足至10 mL，称为透析液。测定经不同规格透析袋处理后的透析液和渗出液对PPO的抑制效果，以透析前的豌豆发酵液作为对照。每处理重复3次。

1.2.8 不同极性有机溶剂萃取后发酵液对马铃薯PPO的抑制效果

取豌豆发酵液200 mL，以4倍量体积分数95%乙醇提取 3次，时间分别为 4、2、2 h，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，得到总浸膏。浸膏用水分散，依次用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。分别对各相进行减压蒸馏至无有机试剂味，测定每一部分样品对马铃薯PPO的抑制效果。

1.3 数据处理

采用SAS软件对所得的数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 豌豆发酵液与常用褐变抑制剂对马铃薯PPO抑制效果的比较

测定了低、中、高3个浓度下豌豆发酵液和未发酵豌豆液对马铃薯PPO的抑制活性，并且与亚硫酸氢钠、抗坏血酸、柠檬酸和EDTA－Na24种常用褐变抑制剂的作用效果进行了比较。结果见表1。

表1 豌豆发酵液与常用褐变抑制剂对马铃薯PPO的抑制效果比较

由表1可以看出，亚硫酸氢钠和抗坏血酸对马铃薯PPO的抑制效果最明显，而柠檬酸和EDTA－Na2的抑制效果较差。浓度为90 mg/mL的豌豆发酵液对马铃薯PPO的抑制率达到了100%，与0.2 mg/mL的亚硫酸氢钠、0.4 mg/mL的抗坏血酸的抑制效果相当。豌豆发酵液的浓度越大，其对马铃薯PPO的抑制效果越好，这一结果与徐涵等[9]的研究一致。120 mg/mL的未发酵豌豆液对马铃薯PPO的抑制率也达到了68.63%，说明豌豆浆液本身具有抗褐变效果，但其效果没有发酵后的豌豆浆液好，这可能跟发酵过程中乳酸菌产生的许多小分子代谢物质，包括酸、乙醇、丁二酮、H2O2和其他代谢产物，具有较强的络合金属离子能力和较高的抗氧化性，能有效抑制酶促褐变有关[14]。这也说明了豌豆发酵液中的抗褐变成分可能不是单一组分，而是几种成分的协同作用。

2.2 豌豆酸浆发酵液化学成分预试结果

采用试管法和圆形滤纸层析法对发酵液发酵前后的化学成分进行了预试，见表2。结果表明 ，从化学成分看发酵液发酵前后都含有氨基酸、蛋白质、多糖、皂苷、有机酸、多酚类、黄酮类、内酯类，而发酵后的酵液中未检出生物碱、油脂、甾体、萜类等物质。这说明豌豆发酵液中的有效抗褐变成分不是生物碱、油脂、甾体、萜类物质，可能是氨基酸、蛋白质、多糖、皂苷、有机酸、多酚类、黄酮类中的一种或几种。

2.3 热处理对发酵液抗褐变活性的影响

豌豆发酵液经过不同温度，不同时间处理后对马铃薯PPO的活性抑制情况见图1。

图1 豌豆发酵液的热处理对马铃薯PPO抑制作用的影响

经统计学分析，豌豆发酵液在室温、40、60、80、100℃分别处理30 min和60 min后，各处理在5%显著性水平上差异不显著(P＞0.05)。0.1 MPa灭菌30 min和60 min后，豌豆发酵液对马铃薯PPO的抑制活性分别下降了5.32%和9.62%。说明了豌豆发酵液中的褐变抑制成分是一种或几种对热稳定的物质。此外，由于热处理可以使蛋白质变性，此结果也间接说明了豌豆发酵液中抗褐变成分不是蛋白质类物质。

表2 豌豆酸浆粗发酵液成分预试结果

2.4 pH对发酵液抗褐变活性的影响

发酵液在不同pH条件下处理30 min后测定各处理组对马铃薯PPO的抑制效果，以未经酸碱处理的试样作为对照，结果见图2。

图2 豌豆发酵液的酸碱稳定性测试结果

由图2可知，豌豆发酵液经酸碱调节后，未调回原pH 3.95的情况下，在pH 2时对PPO的抑制率达到了85%，而在pH 4～10时，随着pH的升高对PPO的抑制率下降，在pH 12时，对PPO的抑制率又有所增加。出现这种情况的原因可能是在强酸强碱环境下，PPO本身没有处于最适 pH范围(pH 5～8)[15]有关，由于这种情况的干扰，此方法不能科学的反应豌豆发酵液的酸碱稳定性。因此改进方法如下:将豌豆发酵液经酸碱调节后，放置30 min，再将各处理调回原pH 3.95进行抗褐变效果的测定，结果表明，豌豆发酵液经强酸强碱处理后，对PPO的抑制活性经统计学分析，并无显著性差异(P＞0.05)，说明褐变抑制成分没有受到强酸强碱破坏，其酸碱稳定性较好。

2.5 发酵液中抗褐变成分的分子质量预估

将豌豆发酵液用不同规格的透析袋进行透析处理，并测定了处理后的发酵液对马铃薯PPO的抑制效果，结果见图3。

图3 豌豆发酵液经不同截留分子量透析后各部分对马铃薯PPO的抑制作用

由图3可知，豌豆发酵液经截留分子量分别为8 000、3 500和1 000 u的透析袋透析处理后，透析液对马铃薯PPO的抑制效果均在10%以下，而渗出液对马铃薯PPO的抑制效果均达到了80%以上，另外，考虑到透析不完全等因素也会导致部分有效成分不能完全被透析出来，因此，可以初步认定豌豆发酵液的抗褐变成分的分子质量在1 000 u以下。豌豆发酵液经截留分子质量为500 u的透析袋处理后，透析液对马铃薯PPO的抑制率仅为21.21%，而渗出液对马铃薯PPO的抑制率也只有48.57%，由于考虑到透析不完全等因素，目前还不能得出豌豆发酵液抗褐变成分的分子质量在500 u以下的结论，结果有待进一步试验。综合以上分析可以初步推断，豌豆发酵液的抗褐变成分为小分子物质，可以排除蛋白质、多糖等大分子物质。

2.6 不同极性有机溶剂萃取后发酵液的抗褐变效果

测定了不同极性有机溶剂萃取后的豌豆发酵液对马铃薯PPO的抑制效果，结果见图4。

图4 豌豆发酵液经萃取后各萃取段对马铃薯PPO的抑制作用

由图4可知豌豆发酵液经95%乙醇除杂，浓缩后，再依次经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取分段，将经真空浓缩除去有机试剂后的各部分再用氮气吹去残余试剂，最后分别定容到初始体积，测定各部分对马铃薯PPO的抑制效果。结果表明，水相对马铃薯PPO的抑制作用最显著，抑制率为37.59%；其次是乙酸乙酯相，抑制率为30.9%；正丁醇相的抑制率为16.13%；石油醚相浓缩到10 mL后对马铃薯PPO的抑制率仅为2.26%，几乎没有抑制效果。根据相似相容原理可以判定，豌豆发酵液中的抗褐变因子很可能是一种或几种极性较大的物质。

3 讨论与结论

国内外对抑制果蔬褐变的研究很多，主要采用化学抑制剂抑制果蔬加工过程中的酶促褐变。本试验研究了天然豌豆发酵液对马铃薯PPO的抑制作用，并对豌豆发酵液中的抗褐变成分进行了初步探索。结果表明:(1)豌豆发酵液对马铃薯PPO有很强的抑制效果，90 mg/mL的豌豆发酵液对马铃薯PPO的抑制率达到了100%，其对马铃薯PPO的抑制效果与0.04mg/mL的亚硫酸氢钠、抗坏血酸相当，比0.08 mg/mL的柠檬酸和EDTA－Na2的效果好。(2)采用试管法和圆形滤纸层析法对发酵液进行了化学成分的分析，豌豆发酵液中主要含有:氨基酸、蛋白质、多糖、皂苷、有机酸、多酚类、黄酮类、内酯类等物质。(3)豌豆发酵液的抗褐变成分具有良好的热稳定性和较广的pH耐受范围，在pH 2～12的范围内能较好的保持其抗褐变活性。100℃以下不同温度处理30 min后发酵液对马铃薯PPO的抑制活性跟处理前相比没有显著的差异。(4)发酵液中的，有效抗褐变成分为分子质量小于1 000 u的极性较大的小分子物质。综上所述，豌豆发酵液的抗褐变成分可能是有机酸、多酚和黄酮类物质中的一种或几种。

豌豆发酵液是一种安全无毒、高效的天然抗褐变物质，本试验为进一步鉴定豌豆发酵液中抗褐变成分提供了重要参考。

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