p75NTR对兔陈旧性心肌梗死心室肌跨膜复极离散度的作用*

张建成，陈美烟，李 泱，傅义程，高进辽

（1.福建医科大学省立临床医学院，福州350001；2.解放军总医院老年心血管病研究所，北京100853）

近年发现神经生长因子的营养因子p75受体（neurotrophin p75 receptor，p75NTR）与心脏交感神经生长发育及分布密度相关，尤其在心肌梗死后心肌组织交感神经的过度增生过程中起重要作用［1］。p75NTR在交感神经生长过程中呈高表达，当突触一旦成功联接外周靶器官后，这种表达立即降低。在心脏自主神经系统中，p75NTR主要在心室高表达，神经生长因子（nerve growth factor，NGF）可通过其促进交感神经纤维增生，而交感神经过度支配的心室间质细胞的p75NTR表达较低；p75NTR分布于心脏神经干及神经末梢，而且主要存在于新生的交感神经中［2］。心肌梗死（myocardial infarction，MI）后神经过度增生可促进梗死心脏的电不稳定性。研究证明交感神经在心脏中并非呈均匀分布，其主要存在于心室肌外膜下，并呈跨室壁梯度分布的特点。MI后在梗死周边区空间分布紊乱，呈现较大的不均一性。正常心肌组织上p75NTR主要通过介导细胞凋亡发挥抑制交感神经的生长作用，而病理状况下该受体的表达减少将引起凋亡途径抑制，从而导致交感神经过度增生［3］。与此同时，MI后心肌本身发生一系列电重塑，心脏左室跨壁三层心肌动作电位时程不均匀性延长，导致跨室壁复极离散度（transmural dis-persion repolarization，TDR）显著增加，最终引起心律失常的发生。因此本文通过干预p75NTR及对MI后兔心室肌TDR的作用，来探讨心梗后心律失常发生的原因。

1 材料与方法

1.1 试剂

胶原酶II、胰蛋白酶、牛血清白蛋白、天门冬氨酸钾（K-aspartate）、丙酮酸钠（Na-pytuvate）、MgATP、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、氯化钙（CaCl2）、氯化镉（CdCl2）、氯化钡（BaCl2）、4-氨基吡啶（4-aminopyridine，4-AP）均为Sigma公司产品；乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）购自Fluka Biochemika；其他试剂均为分析纯。

Tyrode液的组成成份（mmol／L）：NaCl 135，KCl 5.4，CaCl21.8，MgCl21.0，NaH2PO40.33，HEPES 10，glucose 10，pH值用 NaOH调至 7.3；无钙 Tyrode液和0.2mmol／L Ca2＋Tyrode液，分别为 Tyrode液中不加CaCl2和加 0.2mmol／L CaCl2

记录钾电流的细胞外液（mmol／L）：N-methyl-D-glucamine（NMG）149，MgCl25，CaCl20.65，HEPES 5，用 HCl调 pH值至7.4。

记录钾电流的细胞内液（mmol／L）：KCl 45，K-aspartate 85，Na-pytuvate 5，MgATP 5.0，EGTA 10，HEPES 10，glucose 11，用 KOH调 pH值至 7.4。

细胞保护液（KB液，mmol／L）：L-Glutamic acid 50，KCl 30，KOH 80，KH2PO430，taurine 20，EGTA 0.5，HEPES 10，glucose 10，MgSO43，用 KOH调 pH值至 7.4。

1.2 动物模型的建立

日本大耳兔40只，雌雄不拘，体重1.5～2.0 kg（自解放军总医院实验动物中心）随机分成4组（n＝10）：Sham组、HMI（healed myocardial infarction）组、p75NTR激活组和p75NTR抑制组。HMI组结扎冠状动脉左回旋支中下1／3处，扎线以下的心肌出现局部紫绀，心电监护胸前导联ST段抬高，立即静脉给予利多卡因25mg，观察30 min后关胸，术后喂养10周，造成HMI模型；p75 NTR激活组亦行上述冠状动脉结扎术，并行颈部正中切口，放置直径1.5 mm乙烯管于左侧星状神经节处（LSG），另一端经皮下隧道于颈背部穿出，供注射NGF用400 U×30 d；p75 NTR抑制组：采用与NGF同样方法植管，于术后经导管注射p75NTR受体单克隆抗体50 U×30 d。假手术组开胸但不结扎冠状动脉和颈部置管，术后四组均肌注青霉素3 d。四组动物术后单笼喂养。

于术后30 d，取每组家兔检测心脏基础指标，包括心率、心重／体重、左室周边区厚度、心肌梗死范围，沿左心室长轴将心室水平切为间隔0.25 cm的心肌环，计算心肌环梗死长度占全部心肌环长度的比率，作为心肌梗死的范围。

1.3 室颤阈值的测定

术后10周，实验兔3%戊巴比妥钠静脉麻醉，心电监护，气管插管接呼吸机，开胸，缝制心包吊床。双极起搏电极，直径 0.3 mm，两针相距 0.3 cm，在心肌梗死兔梗死苍白色边缘2 mm处，刺入2 mm深，假手术组起搏电极放置于心脏的相应部位。用XD-22A心脏诊疗仪间断刺激（100 Hz，每次持续刺激1 s），强度从1 V开始，每次按递增0.5 V的方法通过起搏电极刺激心脏，以引起心室颤动的最低强度为室颤阈值。

1.4 离体心脏跨室壁三层心肌单相动作电位记录

离体心脏灌流试验观察 Sham组、HMI组、p75NTR激活组和p75NTR抑制组的复极时程改变。心脏快速剪下放入台氏液中停搏台氏液（mmol／L）：NaCl 118、KCl 5.8、MgCl21、CaCl21.8、NaH2PO41、NaHCO324.88、葡萄糖 5.55，以 NaOH调整 pH值至7.4。修剪心脏主动脉插管进行Langendorff台氏液灌流灌流压70 mmHg温度37℃、95%纯氧和5%二氧化碳饱和热烙术捣毁房室结和希氏束直到出现缓慢的室性逸搏心律要求逸搏周期达1 000 ms以上IBZ位于梗塞纤维化的苍白色边缘3 mm内NIZ位于梗塞纤维化的苍白色边缘6 mm之外，参照文献［4］报道的方法心外膜MAP电极用外壳包有聚四氟乙烯的银丝直径0.3 mm制成吸附式电极固定于IBZ和NIZ心外膜表面Sham组放置在心外膜相应部位参比电极固定于主动脉根部MAP电极连接于BL-400生物信号采集与处理系统（泰盟电子有限公司生产四川成都）经A／D转换输入计算机调节面板上的时间参数为0.1滤波为500～1 000 Hz用电生理刺激仪华子电子仪器厂生产河南开封以周长1 000ms起搏右室稳定20 min后同步记录心肌MAP，并计算TDR（心梗周边区心外膜与心内膜及中层心肌MAPD90的差值）。

1.5 跨室壁三层心室肌细胞分离

于术后30 d，取各组剩余家兔按文献采用酶解法制备心室肌单细胞并进行了改进。取兔（约1.5～2.5 kg）经戊巴比妥钠（30 mg／kg，iv）麻醉，迅速取心脏，在37℃和通氧条件下行Langendorff灌流。用无 Ca2＋Tyrode′s液灌流 3～5 min，用含Ⅰ型胶原酶16mg、蛋白酶E 5.0 mg和牛血清白蛋白5.0 mg的无 Ca2＋Tyrode′s液灌流（40 ml）10 min以消化心肌。除心房肌，取左室游离壁，用剃须刀平行于心室游离壁分别切取心外膜肌条（≤1.5 mm）和心内膜肌条（≤1.5 mm），余下部分为中层心肌，将上述三层心肌切碎并分别置于含有上述胶元酶的无Ca2＋Tyrode′s液灌流中继续血血清白蛋白和200 U／ml氨苄青霉素的Tyrode′s液中，室温保存1 h。取保存液加于1ml灌流槽中，待细胞贴壁后，于倒置显微镜下选择边缘整齐、表面无颗粒、横纹清晰、无收缩的细胞，在37℃下进行实验。

1.6 跨室壁三层心室肌细胞动作电位和电流的记录

采用全细胞膜片钳记录方法，在电流钳模式下记录动作电位；在电压钳制下记录电流。膜片钳放大器（AXON-700B，USA）同计算机连接。刺激信号及电压输入信号的采集均由软件（pCLAMP）控制。玻璃毛坯（GG-17）经微电极拉制仪（Narishige，pp-83）拉制成电阻为2.5～3.5 MΩ的电极。调节三维操纵器进行封接，使封接电阻达1 GΩ以上，吸破细胞膜形成全细胞记录模式。测定电容时，施以0.4 V／s的斜坡刺激，测电流并按方程 Cm＝I／（dV／dt）计算，其中Cm为膜电容，I为电流值，dV／dt即电压斜率。为消除细胞间误差，电流值以电流密度（pA／pF）表示。信号经截止频率为1 kHz的四阶贝塞尔低通滤波器滤波，采样率为5 kHz。在记录动作电位时采用电流钳模式，在记录电流时采用电压钳模式。

1.7 数据处理

数据以均数±标准差（±s）表示，数据处理采用 pCLAMP 9.2处理，采用 SPSS 10.0软件进行统计学处理，用oneway ANOVA和t-test分析。

2 结果

2.1 家兔心梗模型的制备及心脏基础指标的改变

陈旧性心梗（HMI）组有8只制模成功，1只术中发生心律失常至室颤死亡，另1只在饲养过程中死亡；p75 NTR激活组有7只制模成功，其中3只均死于术后饲养过程中；p75NTR抑制组8只成功，1只死于术后感染，另1只在饲养过程中死亡；假手术（Sham）组10只制模成功。

结果可见，HMI组和p75 NTR激活组的心率、心重／体重、左室周边区厚度较 Sham组明显增加。HMI组与p75 NTR激活组之间差异无显著性。p75 NTR抑制组较HMI组与p75 NTR激活组均有所减少，更接近于Sham组（表1）。

Tab.1 Change of heart basic indicators of every group（±s）

Tab.1 Change of heart basic indicators of every group（±s）

HMI：Healed myocardial infarction；HMI＋p75NTR（＋）：Application p75NTR activator of healed myocardial infarction；HMI＋p75NTR（-）：Application p75NTR inhibitor of healedmyocardial infarction*P＜0.05 vs sham group

Group Heart rate（beats／min）Heartweight／body weight（g／kg）Thickness of left ventricular border area（mm）Infarction area（%）Sham（n＝10） 226±25 3.87±0.14 4.84±0.41 0 HMI（n＝8） 256±31 5.42±0.21* 7.42±0.51* 13.2±3.2 HMI＋p75NTR（＋）（n＝7） 272±28 6.58±0.15* 7.80±0.48* 16.8±4.7 HMI＋p75NTR（-）（n＝8）235±22 3.67±0.17 5.47±0.37 10.6±4.2

2.2 室颤阈值的测定

p75 NTR激活组的室颤阈值为（8.32±1.34）V，较HMI组和 Sham组室颤阈值显著升高（10.01±1.11）V，与p75 NTR激活组相比有显著性差异（P＜0.05）。

2.3 离体心脏跨室壁三层心肌单相动作电位及复极离散度

在1 000ms起搏周长HMI组和p75NTR激活组TDR分别为（34.6±6.4）ms、（57.9±6.8）ms较Sham组（9.6±2.6）ms有显著性差异（P＜0.01），HMI组与NGF组之间亦有显著性差异（P＜0.01），而p75 NTR抑制组 TDR虽然延长，但幅度较小，为（27.6±4.1）ms，与 HMI组和 p75 NTR激活组均有显著性差异（P＜0.01），但与假手术组也有显著性差异（P＜0.01，图 1、表 2）。

Fig.1 Three layers ofmyocardial single-phase action potential of every group（MAPD）

2.4 跨室壁三层心室肌细胞动作电位及复极离散度

假手术组Mid细胞的APD明显长于 Endo和Epi，以Endo的APD最短，即三层心肌细胞间的APD存在跨室壁离散。与假手术组相比，HMI组三层心肌细胞的APD90均延长，以Mid细胞的APD90延长更明显，TDR显著增加。p75NTR受体激活组使这种变化更加明显，而p75NTR受体抑制组细胞则显示三层心肌细胞的APD较p75NTR受体激活组和心梗组明显减小，TDR降低，与p75NTR受体激活组有极显著差异，但仍较大，与假手术组相比也存在明显差异（P＜0.05，P＜0.01，图 2、表 3）。

Tab.2 Single-phase action pontential and transmural dispersion repolarization of every group（±s）

Tab.2 Single-phase action pontential and transmural dispersion repolarization of every group（±s）

MAPD20：Duration of20%myocardial single-phase action potential；MAPD50：Duration of50%myocardial single-phase action potential；MAPD90：The duration of 90%myocardial single-phase action potential；TDR：Transmural dispersion repolarization；ECG：Electrocardiography；Epi：Epicardial；Mid：Midcardial；Endo：Endocardial**P＜0.01 vs sham group；＃＃P＜0.01 vs HMIgroup

Group Endo MAPD90 MAPD50 MAPD20 MAPD90 MAPD50 MAPD20 MAPD90 MAPD50 MAPD20 TDR（ms Epi Mid）Sham（n＝10） 253±26.0 198±17.0 138±13.0 282±25.0 235±18.0 158±16.0 254±18.0 188±22.0 135±17.0 29±3.0 HMI（n＝8） 283±25.0** 266±21.0** 196±18.0** 334±34.0** 297±15.0** 173±20.0 277±19.0 219±24.0 187±14.0** 57±9.0**HMI＋p75NTR（＋）（n＝7） 342.7±41.3**＃＃291.8±52.1**＃＃204.6±15.0** 404.4±55.7**＃＃322.9±56.0**＃＃230.7±17.4** 396.2±14.2**＃＃254.5±18.4**＃＃198.8±15.8** 62±7.0**HMI＋P75NTR（-）（n＝8） 261±19.0 194±23.0 146±14.0 300±26.0 236±22.0 156±17.0 256±18.0 192±15.0 133±18.0 48±6.0**

Tab.3 Three layers of action pontential and transmural dispersion repolarization of every group（±s）

Tab.3 Three layers of action pontential and transmural dispersion repolarization of every group（±s）

APD20：Duration of 20%action potential repolarization；APD50：Duration of 50%action potential repolarization；APD90：Duration of 90%action potential repolarization；TDR：Transmural dispersion repolarization*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group；＃＃P＜0.01 vs HMIgroup

Group Endo APD90 APD50 APD20 APD90 APD50 APD20 APD90 APD50 APD20 TDR（ms Epi Mid）Sham（n＝12） 242.6±45.2 114.7±23.0 56.2±17.9 294.5±52.3 175.0±46.4 80.2±26.8 239.2±40.3 107.5±24.4 53.2±15.2 52±8.1 HMI（n＝14） 301.7±51.2* 151.8±26.8* 64.6±15.6 366.4±53.1** 232.9±36.4* 110.7±27.1 289.2±34.3* 146.5±20.5* 67.8±10.5 78±9.2*HMI＋p75NTR（＋）（n＝15） 340.7±42.2**＃＃191.8±32.0** 84.3±19.3* 402.4±45.6**＃＃289.9±36.1** 153.7±13.4* 306.2±60.2** 174.5±28.9** 88.8±12.3* 96±14.9**HMI＋P75NTR（-）（n＝15） 283.1±45.0 128.6±33.8 58.5±9.4 337.0±42.2 254.1±30.6 121.0±24.5 268.4±38.7 119.6±17.2 75.8±11.4 65±13.5

Fig.2 Three layers ofmyocardial single-celled action potential of every group

2.5 跨室壁三层心室肌细胞瞬时外向钾电流

保持电位-80 mV，施予-40 mV，20 ms的预刺激失活钠通道，紧接着给予-40～＋50mV，300ms的脉冲，记录 Ito。其可被5 mmol／L 4-AP完全阻断。四组中Ito电流密度均以中层心肌细胞最大，外膜细胞次之，内膜细胞最小。在＋50 mV的去极化刺激时，p75NTR受体激活组和HMI组三层心肌Ito峰电流密度较假手术组均明显下降（P＜0.05，P＜0.01），以中层心肌下降程度最大。其中p75NTR受体激活组较假手术组三层心肌细胞分别下降（Epi：32.4%，Mid：41.9%，Endo：26.3%），与而假手术组相比，p75NTR受体抑制组电流密度明显不大，二者之间也无显著性差异（P＞0.05，图 3、表 4）。

Fig.3 Three layers ofmyocardial single-celled transient outward potassium current of every group

Tab.4 Three layers ofmyocardial single-celled transient outward potassium currentdensity ofevery group（pA／pF，±s，＋50 mV）

Tab.4 Three layers ofmyocardial single-celled transient outward potassium currentdensity ofevery group（pA／pF，±s，＋50 mV）

Epi：Epicardial；Mid：Midcardial；Endo：Endocardial*P＜0.05，**P＜0.01 vs sham group； ＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs HMI＋p75NTR（＋）

10.8±1.6 Group Epi Mid Endo Sham（n＝10） 29.1±2.4 32.3±3.3 11.5±2.5 HMI（n＝12） 23.4±2.5*25.4±3.2* 9.1±0.8 HMI＋p75NTR（＋）（n＝13）20.9±1.9*17.3±0.6**7.8±1.1 HMI＋p75NTR（-）（n＝12） 25.2±2.5＃ 29.3±3.7＃＃

2.6 跨室壁三层心室肌细胞延迟整流钾电流

保持电位-50mV，施予-20 mV～＋70 mV，7 s的去极化脉冲，记录时间依赖性电流（IKs），复极至-30 mV时，记录尾电流（IKs，tail）。各组中层心肌细胞 IKs和IKs，tail均较外膜细胞和内膜细胞小。在＋70 mV的去极化刺激时，p75NTR受体激活组三层心肌IKs，tail电流密度较假手术组及p75NTR受体抑制组明显下降，以中层心肌下降比例最大约为32.1%与Epi（20.4%）和 Endo（19.5%）相比有显著性差异（P＜0.05，P＜0.01，图 4、表 5）。

Fig.4 Three layers ofmyocardial single-celled delayed rectifier potassium current of every group

Tab.5 Three layers ofmyocardial single-celled delayed rectifier potassium current density of every group（pA／pF，±s，＋70mV）

Tab.5 Three layers ofmyocardial single-celled delayed rectifier potassium current density of every group（pA／pF，±s，＋70mV）

*P＜0.05，**P＜0.01 vs Sham group；＃P＜0.05 vs HMI＋p75NTR（＋）

Group Epi Mid Endo Sham（n＝12） 6.3±1.2 3.7±1.1 5.3±1.9 HMI（n＝14） 4.7±1.1* 3.2±0.9 4.2±0.8 HMI＋p75NTR（＋）（n＝14）3.9±0.7**2.0±0.3**3.8±0.5*HMI＋P75NTR（-）（n＝12） 5.4±1.0＃ 3.3±0.4＃4.7±1.1

3 讨论

本研究发现，无论是整体心脏还是单个心室肌细胞，心梗后复极离散度均增加，事先用NGF激活p75NTR后，复极离散度增加更显著，相反在用p75NTR抗体抑制后离散度改变被缓解，室颤阈值也得到相应的增加。提示p75NTR激活直接参与心肌梗死后的电重塑，使跨室壁复极离散度增加，这可能是心梗后发生恶性心律失常或猝死的主要原因。研究还显示，用p75NTR激活后三层心肌细胞Ito峰电流密度均下降，但降低程度各异。p75NTR受体激活组三层心肌IKs，tail电流密度较Sham组及p75NTR受体抑制组明显下降。本文的实验结果与 Heath BM［5］报道相符，我们推测这种改变可能是由于通道稳态失活和关闭态失活的改变所致，提示MI后，心肌发生一系列电重构，其中通道本身也发生重构，从而影响动作电位时程，导致跨室壁复极离散度增加，最终引起心律失常发生。

Beth［6］等发现，p75NTR主要调节交感神经的发育和稳定，也制约着交感神经纤维的分布，进而影响心脏功能的发挥。通过对p75NTR-／-小鼠的研究，发现右心房的交感神经主干分布明显减少，且交感神经纤维分布不均衡，导致交感神经递质释放降低，继而降低基础心率和应激系统对去甲肾上腺素的反应。我们的结果进一步证明，p75NTR在交感神经分布及其生长发育过程中发挥重要作用，并与其分布的异质性密切相关。其作用机制可能是，p75NTR不仅促进交感神经的增生，而且还调节心脏神经递质的释放，实现心脏生理功能，此效应为 p75NTR与TrkA／B两者协同作用的结果［7，8］。Slonimsky［9］等发现p75NTR、BDNF及CaMKII相互作用促进抑制性神经递质释放。最新研究证实［10］，小鼠心肌梗死模型中，NGF过度表达减少梗死周围内皮细胞和心肌细胞的死亡，同时改善新生血管形成、心肌灌注及左心室射血分数，但不是由TrkA或p75NTR所介导。我们的发现说明，NGF是通过p75NTR的作用，而且可能存在直接对电重塑的作用。这困难成为防治心梗的新的作用靶点。

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