低氧对胃癌细胞增殖及LINE-1核酸内切酶变异体GCRG213表达的影响*

田 宇，黄 欣，赵 彤，朱玲玲，王刚石△

（1.中国人民解放军总医院南楼消化科，北京100853；2.军事医学科学院基础医学研究所，北京100850）

胃癌是胃粘膜上皮细胞变异产生的恶性肿瘤，是我国最常见的恶性肿瘤之一。胃癌病因和发病机制尚未阐明，研究资料表明胃癌的发生发展与多种因素有关，随着细胞和分子生物学的发展，针对肿瘤相关基因的研究已成为热点。本实验室应用荧光标记的mRNA差异显示技术，通过比较人胃窦部腺癌组织、癌旁组织和正常胃黏膜组织的基因表达，筛选出一条胃癌高表达基因序列，命名为胃癌相关基因213（gastric cancer related gene 213，GCRG213），该基因序列具有完整的开放读码框（open reading frame，ORF）［1］，在胃癌组织可以检测到 GCRG213蛋白高表达，并且该基因可能具有促进胃癌细胞增殖的作用［2］。文献报道，肿瘤的增殖特性与其在体内的低氧环境密切相关，低氧环境是实体肿瘤的普遍特征，并具有通过改变基因表达促进肿瘤形成发展的潜能，从而进一步导致肿瘤相关蛋白表达的改变，包括细胞周期调节蛋白、血管生成调节蛋白、肿瘤转移相关蛋白、代谢酶及转录因子等［3］，因此研究低氧环境下肿瘤相关基因的表达变化具有重要意义。目前，在肿瘤细胞生存的低氧环境下，GCRG213基因的表达变化尚不明确。我们近期利用更新的 NCBI／GeneBank数据库分析GCRG213序列，发现其为人长散在核元件-1（long interspersed nuclear element-1，LINE-1）家族成员，本研究利用细胞低氧培养箱模拟低氧微环境，分别在20%O2及3%O2环境下培养正常胃粘膜细胞GES-1及胃癌细胞BGC-823，观察低氧对细胞增殖及GCRG213表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

正常胃粘膜细胞GES-1与胃癌细胞BGC-823由解放军总医院南楼消化科实验室保存。1640培养液、胎牛血清及胰蛋白酶均购自Hyclone公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、二甲基亚砜及β-actin单克隆抗体购自Sigma公司；PVDF膜购自 Millipore公司；蛋白裂解液、Western blot超敏发光液购自北京普利莱公司；GCRG213单克隆抗体由解放军总医院消化科实验室制备并保存；HRP-标记的羊抗鼠二抗购自MBL公司；Trizol购自Invitrogen公司；RT-PCR试剂盒购自Takara公司。其余试剂均为国产或进口分析纯试剂。

1.2 细胞培养

正常胃粘膜细胞GES-1及胃癌细胞BGC-823培养在含10%胎牛血清的RMPI 1640培养基中，每2天换液一次，每5天传代一次，细胞贴壁生长面积达培养瓶底部面积的80%且细胞生长状态良好时，进行传代分组。应用低氧培养箱（Thermo 3111，Billups-Rothenberg，Del Mar，CA）模拟 3%O2浓度的低氧微环境。将正常胃粘膜细胞GES-1及胃癌细胞BGC-823分别培养于20%O2和3%O2条件下24 h、48 h后，收集细胞进行细胞增殖、RT-PCR和Western blot的检测。

1.3 MTT检测

收集对数期细胞，调整细胞悬液密度，以3×103cells／well的密度接种到96孔板中，每孔加入200μl细胞悬液。每种细胞设置10个复孔，边缘孔用无菌PBS填充，20%O2，5%CO2，37℃孵育10～12 h后，分别置于20%O2或3%O2培养24 h、48 h。然后每孔加入 20μl MTT溶液（5 mg／ml，即 0.5%MTT），37℃孵育4 h。小心吸去孔内培养液，每孔加入150 μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡5 min，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪A490 nm测量各孔吸光值。

1.4 RT-PCR检测

取对数生长期细胞接种于六孔板中，每孔加入2ml，在 20%O2，5%CO2，37℃孵育 10～12 h后，分别置于20%O2或3%O2培养48 h后收集细胞。使用Trizol试剂盒提取细胞的总RNA，紫外分光光度计检测其浓度和纯度。取1μg总RNA，按试剂盒说明书配制逆转录反应液，先于70℃保温10 min后迅速在冰上冷却2 min，再于 42℃1 h，70℃ 10 min，反应后的cDNA用于后续PCR扩增。PCR反应引物采用Primer Premier 5.0软件设计，GCRG213基因引物序列如下：P1 5＇-AACTGCAGATGCAACAAGAA-3＇，P2 5＇-CGGGATCCAAGTTTTGAGTGAG-3＇，以人β-actin为内参照，反应条件如下：98℃ 10 s，55℃ 5 s，72℃ 45 s，30个循环，凝胶电泳进行检测，结果以与内参照的比值表示。

1.5 Western blot检测

取对数生长期细胞接种于六孔板中，每孔加入2ml细胞混悬液，在 20%O2，5%CO2，37℃孵育 10～12 h后，分别置于20%O2或3%O2中继续孵育48 h。分别从细胞培养箱中取出六孔板，用细胞刮轻刮六孔板底并收集细胞。RIPA裂解缓冲液裂解细胞，采用BCA法蛋白定量，SDS-PAGE，上样蛋白量为 30μg／well，恒压电流，积层胶 60 V，分离胶 120 V电泳至凝胶底部。湿转法转膜，冰浴中以60 V恒压电转120min，10%脱脂奶粉室温封闭2 h。加入用封闭液稀释的一抗，4℃轻摇过夜。次日，取出一抗孵育的PVDF膜，TBST洗3次，每次洗10min；然后，按照1∶2 000比例加入封闭液稀释的二抗，室温轻摇2 h。HRP化学发光法显色。

1.6 序列同源性分析

将GCRG213序列提交到 NCBI／GeneBank，利用BLASTN和BLASTP与GeneBank数据库中序列进行同源性分析，应用 Multalin在线（http：／／multalin.toulouse.inra.fr／）进行 GCRG213序列和 LINE-1序列比对分析。

1.7 统计学分析

实验所测数据以均数±标准差（±s）表示，应用SPSS 11.0软件进行分析，各组间采用t检验方法比较。

2 结果

2.1 低氧对胃癌细胞增殖的影响

结果显示，两种细胞在3%O2环境中的存活率较20%O2环境下增高，经统计分析具有显著差异（P＜0.01，表 1）；进一步分析，将 GES-1及 BGC-823细胞的24 h-20%O2组存活率标准化为1，分别比较每种细胞24 h-3%O2组、48 h-20%O2组、48 h-3%O2组相对存活率水平，发现在相同条件下GES-1细胞相对存活率比BGC-823细胞相对存活率高（图1）。

Tab.1 Effectof hypoxia on GES-1 and BGC-823 cell proliferation（±s，n＝10）

Tab.1 Effectof hypoxia on GES-1 and BGC-823 cell proliferation（±s，n＝10）

**P＜0.01 vs GES-1 cell 20%O2； ＃＃P＜0.01 vs group BGC-823 cell20%O2

24 h 48 h GES-1 cell 20%O2 0.3065±0.0776 0.4733±0.1170 3%O2 0.3584±0.0896** 0.5806±0.0860**BGC-823 cell 20%O2 0.4507±0.0680 0.5790±0.0570 3%O2 0.4809±0.0530＃＃ 0.6721±0.0320 Group A490（nm）＃＃

Fig.1 Effectofhypoxia on GES-1 and BGC-823 cell relative vital rate

2.2 低氧对GCRG213表达的影响

结果表明，与在20%O2条件下相比，GES-1与BGC-823两种细胞在3%O2条件下培养48 h后，GCRG213的mRNA及蛋白表达均有一定程度的升高（图 2、图 3）。

Fig.2 Detection of GCRG213mRNA expression by RT-PCR

Fig.3 Detection of GCRG213 protein expression byWestern blot

2.3 Blast分析结果

经过序列同源分析比对，我们发现GCRG213核苷酸序列与LINE-1的第二个ORF（ORF2）序列93%同源，并且，GCRG213-ORF编码的氨基酸序列与LINE-1 ORF2中核酸内切酶（LINE-1 endonuclease，L1-EN）序列83%同源，结果见示意图（图4）。GCRG213在GeneBank上的登录号为AY053451。

Fig.4 Relationship between GCRG213 and LINE-1.LINE-1 element，total length 6 049 bp，consists of the 5′-and3′-UTRs and two ORFs.LINI-1ORF2 containsendonuclease（EN）and reversetranscriptase（RVT）.The deduced amino acid sequence of GCRG213-ORF shared 83%homology with L1-EN sequence

3 讨论

近年来低氧微环境与肿瘤的关系倍受关注，低氧可通过调控多种基因的表达进而影响肿瘤细胞的生物学特性。为探讨低氧对胃癌细胞BGC-823中GCRG213表达是否具有调控作用，我们应用细胞低氧培养箱对正常胃粘膜细胞GES-1及胃癌细胞BGC-823进行体外模拟低氧处理。MTT结果显示，培养24 h及48 h后，与20%O2环境相比，3%O2培养的两种细胞存活率均升高。经进一步分析发现，3%O2环境下GES-1的增殖率较BGC-823的增殖率高。有文献报道认为，低氧可导致肿瘤细胞周期蛋白 D1表达减少，引起 G0／G1期阻滞［4］，低氧激活NF-κB引起细胞周期蛋白D1、D3表达下降，也可引起细胞周期停滞［5］，故低氧环境下肿瘤细胞早期虽仍存活，但其分裂增殖已基本停止。正常胃粘膜细胞GES-1是通过SV40病毒转化人胃上皮细胞得到的可在体外长期传代的细胞系，具备永生化细胞的部分特性。鉴于低氧培养48 h后细胞增殖升高明显，进一步采用该条件处理后，应用Western blot及RT-PCR方法检测细胞中GCRG213蛋白及mRNA的表达。结果一致显示，3%O2环境下GCRG213表达较20%O2环境培养组增高，表明3%低氧可使细胞中GCRG213基因表达增高。既往研究认为，GCRG213在胃癌组织中高表达，且可能具有促进胃癌细胞增殖的作用，可见GCRG213在胃癌细胞低氧微环境下的增殖中可能发挥一定的作用。

基于以下理由，我们认为GCRG213是有功能的L1-EN变异体：（1）GCRG213序列与 LINE-1 ORF2序列高度同源；（2）GCRG213-ORF编码的氨基酸序列与L1-EN序列高度同源；（3）我们既往研究证实GCRG213可以促进胃癌细胞增殖；（4）文献报道很多组织能产生有功能的LINE-1 ORF2片段。本研究结果显示，细胞经低氧环境处理后，其GCRG213表达升高；近期有研究证实，低氧可以使LINE-1 ORF2中逆转录酶基因片段表达升高［6］，这与本实验结果相呼应。

人类基因组的97%由内含子、移动元件、简单重复序列等构成，近五年来对这些序列及其功能的研究已成为热点，LINE-1是其中的重要组成部分，占人类基因组的17%。LINE-1包含ORF1和ORF2两个开放读码框，ORF2具有核酸内切酶和逆转录酶活性（图4）。LINE-1活动可以导致基因性疾病，并且与肿瘤和衰老都密切相关，在正常组织和细胞中处于沉默状态［7，8］，但在多数的永生细胞和恶性肿瘤细胞中高表达［9］，且活性较强，影响肿瘤细胞的生长。人体内LINE-1通过基因序列及额外核苷酸片段的插入、外显子的删除、染色体倒位及5＇端转导作用等方式，引起基因组不稳定性［10］，进而发生癌变。因此在胃癌中进行的关于GCRG213的研究结果有助于我们深入认识LINE-1在肿瘤发生发展中的作用及其分子机制。关于低氧调控GCRG213表达以及GCRG213在细胞增殖中作用的分子机制目前尚不清楚，值得进一步研究。

总之，本研究首次证实体外模拟低氧微环境可使胃癌细胞BGC-823和永生化正常胃粘膜细胞GES-1中的LINE-1核酸内切酶变异体GCRG213表达升高，为研究低氧对细胞中LINE-1片段表达的影响提供了有益的尝试，也为胃癌发生发展的研究提供了新思路。

【参考文献】

［1］ Wang G S，Wang MW，Wu B Y，etal.A gene encoding an apurinic／apyrimidinic endonuclease-like protein is up-regulated in human gastric cancer［J］.WorldJGastroenterol，2003，9（6）：1196-1201.

［2］ Gao L L，Wu B Y，Wang M W，etal.Construction of a gastric cancer related gene GCRG213-specific siRNA expression vector and its effect on gastric cancer cells in vitro［J］.ChinJOncol，2007，29（2）：84-88.

［3］ Liu L，Simon M C.Regulation of transcription and translation by hypoxia［J］.CancerBiolTher，2004，3（6）：492-497.

［4］ Horiuchi A，Imai T，Shimizu M，etal.Hypoxia-indued changes in the expression of VEGF，HIF-1 alpha and cell cycle-related molecules in ovarian cancer cell［J］.Anticancer Res，2002，22（5）：2697-2702.

［5］ Geten FR，Karin M.The IKK NK-KappaB activation pathway-a target for prevention and treatment of cancer［J］.CancerLett，2004，20（2）：193-199.

［6］ Pal A，Srivastava T，Sharma M K，etal.Aberrantmethylation and associated transcriptionalmobilization of Alu elements contributes to genomic instability in hypoxia［J］.JCellMol Med，2010，14（11）：2646-2654.

［7］ Gasior SL，Wakeman TP，Xu B，etal.The human line-1 retrotransposon creates DNA double-strand breaks［J］.JMol Biol，2006，357（5）：1383-1393.

［8］ Xing J，Zhang Y，Han K，etal.Mobile elements create structural variation：analysis of a complete human genome［J］.GenomeRes，2009，19（9）：1516-1526.

［9］ Estécio M R，Gharibyan V，Shen L，etal.LINE-1 hypomethylation in cancer is highly variable and inversely correlated withmicrosatellite instability［J］.PLoSOne，2007，2（5）：e399.

［10］ Chen JM，Masson E，Jr Macek M，etal.Detection of two Alu insertions in the CFTR gene［J］.JCystFibros，2008，7（1）：37-43.