EphA2蛋白调控鼻咽癌紫杉醇敏感性的实验研究

任舒灵，刘 勇 ，李 果 ，谭平清，粟忠武，朱刚才，张 欣 ，田勇泉，邱元正

(中南大学湘雅医院耳鼻咽喉头颈外科，耳鼻咽喉重大疾病研究湖南省重点实验室，湖南长沙 4 10008)

紫杉醇(paclitaxel)在鼻咽癌患者的化疗中取得了令人鼓舞的治疗效果［1］。然而，其在运用过程中耐药性的产生和因剂量过大所产生的毒副作用制约了临床运用的效果［2］。因此，如何减轻鼻咽癌对紫杉醇的耐药性为目前临床与基础研究中的热点和难点。促红细胞生成素产生肝细胞受体A2(erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2，EphA2)为一种受体蛋白酪氨酸激酶，其在恶性肿瘤侵袭转移中的作用一直以来备受关注［3-4］。近年来在卵巢癌的研究中发现，抑制EphA2的表达能在体内外实验中提高卵巢癌细胞对紫杉醇的敏感性［5-6］。因此，本研究拟在体外实验中阐明EphA2是否对鼻咽癌细胞的紫杉醇药物敏感性具有调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料试剂

改良型 RMPI-1 640细胞培养基(Hyclone，美国)，特级胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，0.25%胰蛋白酶消化液(含乙二胺四乙酸)，双抗(青霉素-链霉素，Gibco，美国)，EphA2过表达载体pEGFP-N1-EphA2和空白载体pEGFP-N1(上海吉凯基因化学技术有限公司)，LipofectAMINE 2 000脂质体转染试剂盒(Invitrogen，美国)，兔抗人 EphA2多克隆抗体(Cell Signaling Technology，美国)，Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测试剂盒、小鼠抗人 β-actin单克隆抗体及Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，紫杉醇(Sigma，美国)。

1.2 实验方法

1.2.1 鼻咽癌5-8F细胞培养 本研究所采用的5-8F细胞为鼻咽部低分化鳞癌细胞，由中南大学湘雅医院耳鼻咽喉科实验室提供。该细胞株在 37℃、5% CO2及饱和湿度条件下，用含有10%特级胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素的改良型RMPI-1640细胞培养基进行培养，常规0.25%胰蛋白酶消化传代。所有试验均选用处于对数生长期的细胞。

1.2.2 鼻咽癌5-8F细胞重组质粒转染过程严格按照LipofectAMINE 2 000脂质体转染试剂盒说明书的操作步骤进行。将EphA2蛋白过表达载体pEGFP-N1-EphA2和空白载体pEGFP-N1分别转染鼻咽癌5-8F细胞。转染72 h后采用Western blot检测EphA2蛋白的上调效果。实验共分为3组:①亲本细胞组(未进行基因转染的5-8F细胞);②对照组(转染空白载体pEGFP-N1的5-8F细胞);③实验组(转染过表达载体pEGFP-N1-EphA2的5-8F细胞)。

1.2.3 蛋白印迹法(Western blot)检测EphA2蛋白的表达 提取各组细胞总蛋白，二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid，BCA)测定细胞总蛋白浓度。5 0 μg总蛋白变性处理后，进行1 0%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDSPAGE)电泳。蛋白电泳分离后转膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂牛奶封闭2 h。兔抗人EphA2多克隆抗体(1∶400)于37℃下孵育1 h。洗膜后，辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶3 000)室温下孵育1 h。洗膜后，经化学发光剂显影曝光摄片。以小鼠抗人β-actin抗体(1∶2 000)检测 β-actin含量作为内参照。实验均重复3次。

1.2.4 CCK-8法检测紫杉醇作用后鼻咽癌5-8F细胞生存率 选取对数生长期的各组细胞，0.25%胰酶消化并以每孔7 000个细胞接种于96孔板中，培养24 h后，每组细胞分别给予梯度浓度紫杉醇作用(0、0.001、0.01、0.1、1 、5、10、20、30 nM/L)，每个浓度梯度设有3复孔，阴性对照孔加入同体积培养基。紫杉醇作用48 h后，各孔分别加入10 μl CCK-8溶液，培养箱中孵育1h，酶标仪(检测条件为:主波长450 nm，滤过波长630 nm)检测各孔吸光度(OD)值，根据OD值计算各浓度紫杉醇作用后细胞的生存率，绘制各组细胞生存曲线，计算各组细胞紫杉醇IC 5 0值。本实验重复3次，取平均值。

1.2.5 流式细胞术检测紫杉醇作用后鼻咽癌5-8F细胞周期及凋亡率的改变 选择对数生长期的各组5-8F细胞，0.25%胰酶消化制备成细胞悬液，以每孔20万个细胞接种于6孔板中，细胞培养24 h后，更换含有IC30浓度的紫杉醇溶液的培养基继续作用48 h。胰酶消化后常规培养基吹打成细胞悬液，转移至离心管中，1000 r/min离心 5 min，弃上清，以 PBS溶液重悬、离心、去上清，重复洗涤细胞2次后弃去上清，每组细胞加入1ml 70%乙醇重悬固定细胞，18 h后行流式细胞术检测细胞周期。同法，收集各组细胞进行 Annexin V-FITC和 PI双染色，1h内行流式细胞术检测各组细胞凋亡率。以上实验均重复3次，取平均值。

1.3 统计学方法

用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料以¯x±s表示。采用多样本均数的方差分析进行组间样本均数的比较。所有检验均为双侧检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 上调EphA2蛋白在鼻咽癌5-8F细胞中的表达

为阐明EphA2蛋白在鼻咽癌细胞紫杉醇化疗敏感性中的调控作用，我们首先采用脂质体2 000将EphA2蛋白过表达载体pEGFP-N1-E-phA2和空白载体pEGFP-N1分别转染鼻咽癌5-8F细胞。转染72 h后Western Blot验证转染效果。结果显示空白载体对照组和亲本细胞组EphA2蛋白表达较低，而转染了目的基因的实验组EphA2蛋白表达量显著升高，见图1。

图1 Western Blot验证EphA2蛋白的上调效果

2.2 EphA2蛋白过表达降低鼻咽癌5-8F细胞对紫杉醇化疗敏感性

为了进一步验证EphA2蛋白对鼻咽癌细胞化疗敏感性的调控作用，本实验利用梯度浓度紫杉醇作用于亲本细胞组、对照组和实验组。结果显示实验组细胞对紫杉醇作用IC50为(3.8±0.5 2)nM/L，较亲本细胞组IC 5 0(1.4±0.0 5)nM/L、对照组IC 5 0(1.3±0.06)nM/L均显著升高，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，见图2。提示EphA2蛋白表达上调后鼻咽癌5-8F细胞对紫杉醇的药物敏感性显著降低。

图2 上调EphA2蛋白的表达对紫杉醇作用的鼻咽癌5-8F细胞化疗敏感性的影响

2.3 EphA2蛋白过表达通过改变鼻咽癌5-8F细胞的细胞周期调控其紫杉醇化疗敏感性

在紫杉醇作用48 h后，流式细胞术分析各组细胞周期结果发现:实验组(4 5.7 6±3.89)% 较亲本细胞组(65.85±2.28)%和对照组(64.52±3.31)%的G0/G1期细胞比例明显减少，两组比较差异具有统计学意义(P＜0.05);而 S期细胞的实验组(31.56±1.59)%较亲本细胞组(25.76±1.89)%和对照组(24.55±3.64)%和G2/M期细胞的实验组(2 3.1 0±4.5 5)%较亲本细胞组(8.39±0.81)%和对照组(10.94±3.27)%的比例则明显增多，两组比较差异均具有统计学意义(F值分别为6.521和17.382，P＜0.05);而亲本细胞组与对照组比较，各周期细胞比例不具有统计学意义(P＞0.05)，见图3。

图3 EphA2蛋白过表达对紫杉醇作用的鼻咽癌5-8F细胞周期的影响

2.4 EphA2蛋白过表达对紫杉醇作用后鼻咽癌5-8F细胞的细胞凋亡影响

亲本细胞组、对照组和实验组细胞在紫杉醇作用48 h后，流式细胞术检测各组细胞凋亡率分别为:(8.6 6±1.5 9)%、(7.7 4±1.34)%及(9.84±2.08)%。多样本均数方差分析结果表明，3组间差异均不具有统计学意义(F=1.157，P ＞0.05)，见图 4。

图4 EphA2蛋白过表达对紫杉醇作用的鼻咽癌5-8F细胞凋亡率的影响

3 讨论

紫杉醇为微管作用物质，通过影响微管聚合与解聚的动态平衡，导致细胞周期阻断于G2/M期，从而使癌细胞的生长抑制进而死亡。目前，紫杉醇在鼻咽癌患者的临床运用中取得了令人鼓舞的治疗效果，然而其在运用过程中耐药性的产生和因剂量过大所产生的毒副作用制约了临床运用的效果。现有研究表明紫杉醇耐药的可能因素如下:多药耐药基因(MDR)扩增而使其产物P糖蛋白(P-gp)过度表达，DNA修复机制增强，多药耐药相关蛋白(MRP)等表达异常，凋亡信号途径改变(bcl-2家族等)。其中，MDR及凋亡信号途径改变在紫杉醇耐药中发挥了重要作用［7］。尽管紫杉醇耐药的相关性研究在上述各方面取得一定进展，但其具体分子机制目前仍不十分清楚，尚需从新的角度进行探讨。

促红细胞生成素产生肝细胞受体A2(E-phA2)为一种受体蛋白酪氨酸激酶，为我们前期发现的头颈鳞癌组织与癌旁黏膜组织之间的重要差异表达基因。在前期研究工作中，我们发现EphA2蛋白的表达水平与头颈鳞癌患者的预后呈负相关，为预后的独立影响因素［8］;且通过体内外实验发现 EphA2蛋白能调控头颈鳞癌的生长及转移［9-10］。目前，国内外关于EphA2蛋白的研究多集中在肿瘤的侵袭转移方面，而有关EphA2蛋白对肿瘤细胞化疗耐药影响的研究甚少。仅在卵巢癌［5-6］的研究中发现，抑制EphA2蛋白的表达能在体内外实验中提高卵巢癌细胞对紫杉醇的药物敏感性。

我们前期研究及国内朱国臣等研究均发现EphA2蛋白阳性表达与鼻咽癌临床分期和转移密切相关［10-11］。本研究则进一步在体外细胞实验中发现，EphA2蛋白过表达后能显著降低鼻咽癌细胞对紫杉醇的药物敏感性，且该药物敏感性的改变与EphA2蛋白所致的细胞周期改变密切相关。本研究发现，EphA2蛋白过表达后，在紫杉醇作用下，G1期细胞明显减少，S期和G2/M期细胞则明显增多，即EphA2蛋白过表达的鼻咽癌5-8F细胞较亲本细胞组和对照组表现出更强的生存能力，对紫杉醇的化疗敏感性降低。该研究结果目前在国内外尚未见文献报道。目前，有关EphA2蛋白对紫杉醇药物敏感性的调控仅停留在表型研究层面。鉴于EphA2为一种跨膜受体蛋白，可通过下游复杂的信号通路而影响最终生物学行为的改变。因此，EphA2作为一上游受体蛋白，它是否是通过影响多药耐药基因(MDR)扩增或表达异常，或是DNA修复机制改变，或是凋亡信号途径改变，甚至或是通过肿瘤化疗耐药中的新现象——自噬作用［12］，而最终发挥其对紫杉醇药物敏感性的调控作用，都有待于我们进一步从体内外实验中予以佐证。

综上所述，本研究在体外水平阐明EphA2蛋白可降低鼻咽癌细胞对紫杉醇的药物敏感性。该研究结果进一步丰富了EphA2蛋白在肿瘤研究中的生物功能，为今后利用EphA2蛋白作为鼻咽癌紫杉醇化疗抵抗的分子靶点提供了新的实验数据和理论依据。

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