HPLC法测定补中益气丸中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量

刘富英 窦文渊 谭秀连

（1广东省中医院，广州510120；2中国广州分析测试中心广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广州510070）

HPLC法测定补中益气丸中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量

刘富英1窦文渊2谭秀连1

（1广东省中医院，广州510120；2中国广州分析测试中心广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广州510070）

目的 建立HPLC法测定补中益气丸中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量的方法。方法采用WelchC18色谱柱（4.6mm×250nm，5μm），流动相：以水-乙腈进行梯度洗脱；检测波长为260nm，流速为1.0ml／min，柱温为35℃。结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷在19.6～392μg／mL浓度范围内峰面积与浓度呈良好线性关系（r＝0.9998，n＝6），平均加样回收率为96.5%，RSD＝1.1%（n＝6）。结论本法简便，结果准确，重现性好，可作为补中益气丸的质量控制。

HPLC；补中益气丸；毛蕊异黄酮葡萄糖苷

补中益气丸，是由炙黄芪、党参、炙甘草、白术（炒）、当归、升麻、柴胡、陈皮共八味草药加工而成的传统中成药，该成药为棕褐色至黑褐色的小蜜丸或大蜜丸。功能与主治：补中益气，升阳举陷。用于脾胃虚弱、中气下陷所致的体倦乏力、食少腹胀、便溏久泻、肛门下坠［1］。研究表明黄芪异黄酮化合物对内皮细胞有保护作用［2］。毛蕊异黄酮葡萄糖苷是2010年《中国药典》中黄芪的新增的检测成分，同时也是衡量黄芪质量的一个重要指标。黄芪是补中益气丸处方中的君药，因此，毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量是补中益气制剂一个重要的成分检测指标。以往文献报道毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定，主要是高效液相色谱法［3-10］，高效液相色谱法-串联质谱法［11-12］，高效毛细管电泳二极管阵列法［13］，但未有文献报道以HPLC测定补中益气丸制剂中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量。因此，笔者采用HPLC测定补中益气丸中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量，为有效控制该制剂质量提供了依据。

1 仪器与试剂

日本岛津LC-20AB液相色谱仪（包括二元梯度泵，自动进样器，控温箱，控制系统）；SPD-M20A PDA检测器；岛津LC solution色谱工作站。毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（购于中国药品生物制品检定所，≥98%）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Merck公司），水为高纯水。样品：补中益气丸，由吉林修正集团股份有限公司生产，（规格：9g／粒，批号：20120201、20120202、20120203、20120301、20120302、20120303）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱WelchC18色谱柱（250×4.6mm，5μm）；流动相A：0.5%甲酸，流动相B：乙腈；梯度程序：0～10 min，10～40%B；10.1～20min，40～10%B.检测波长：260nm；流速：1.0ml／min；柱温：35℃；进样量10μl。

2.2 溶液配制

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品10.00mg，置25ml容量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含毛蕊异黄酮葡萄糖苷392μg／ml的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备取样品20个，研细，混匀。取精密称量约5.0g，加入重量1／2的硅藻土，混匀，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇100ml，称定重量，加热回流4h，放冷，摇匀，滤过，精密量取过滤液50ml，回流溶剂至干，残渣用甲醇定容至5ml，用滤膜过滤，配制成供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备按补中益气丸处方比例，制成缺毛蕊异黄酮葡萄糖苷的阴性样品，按“2.2.2”项下供试品溶液配制方法配成阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验对照溶液、供试品溶液和阴性样品溶液分别进样10μl，按色谱条件进行测定，记录色谱图（见图A、B、C）。在上述色谱条件下，理论板数以毛蕊异黄酮葡萄糖苷不低于4000，供试品溶液中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的峰与前后峰分离度均大于1.5，且阴性样品无干扰。

图A 对照品高效液相色图谱

图B 供试品高效液相色图谱

图C 阴性样品溶液高效液相色图谱

2.4 线性关系试验精密量取392μg／ml的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照溶液0.5，1.0，2.5，5.0，7.5ml，置于10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得浓度分别为19.6、39.2、98.0、196、288、392μg／ml的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照溶液，进样10μl，按色谱条件进行测定，记录色谱图，以浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程A＝1916C＋8890，相关系数r＝0.9998（n＝6）。结果表明毛蕊异黄酮葡萄糖在19.6～392μg／ml浓度范围内峰面积与浓度呈良好线性关系。

2.5 精密度试验取批号为“2.2.1”对照品溶液进样10μl，按色谱条件进行测定，连续进样6次，记录峰面积，结果毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液峰面积的RSD＝0.72%（n＝6），表明此仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验取新配制的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24h进样10μl，记录毛蕊异黄酮葡萄糖苷的峰面积，结果RSD＝0.95%，表明毛蕊异黄酮葡萄糖苷供试品溶液在24h内稳定。

2.7 重复性试验精密称取本品适量（批号：20120301），按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进样，记录毛蕊异黄酮葡萄糖苷的峰面积，计算含量RSD为0.85%（n＝6），表明此方法的重复性良好。

2.8 加样回收试验取同一批号（批号：20120301）的样品6份，各精密加入一定量的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果，RSD＝0.70%，表明此方法准确可靠。见表1。

2.9 样品含量测定取6个不同批次的样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，以外标法计算含量（见表2），6批样品的含量均≥0.1mg／g。

表1 加样回收试验测定结果（n＝6）

表2 样品的含量测定结果

3 讨论

以往高效液相测定毛蕊异黄酮葡萄糖的含量的文献中，洗脱条件为等度和梯度洗脱，大多数色谱条件洗脱时间较长，笔者也尝试过，发现补中益气丸成分较多，等度洗脱不能满足实验要求，经过多次试验，最后选择0.5%甲酸水-乙腈作为流动相，进行梯度洗脱效果最理想。

通过SPD-M20A PDA检测器对在190～800nm范围进行扫描，记录毛蕊异黄酮葡萄糖对照品溶液和样品图谱，其中260nm处有较大吸收，因此，检测波长选择260nm。

炙黄芪为黄芪的炮制品，黄芪是豆科植物蒙古黄芪或荚膜黄芪的干燥根，在春节和秋季采挖。不同批次产品测出含量个别相差较大，分析原因可能是由于原材料蒙古黄芪或荚膜黄芪黄芪的干燥根采摘年限和季节的差异，以及黄芪生长环境影响。在一定年龄阶段内，毛蕊异黄酮葡萄糖含量随年龄增高而升高，在生长至6年左右时，毛蕊异黄酮葡萄糖含量达到最高，之后毛蕊异黄酮葡萄糖含量又开始下降。在同样条件下，野生和园林的黄芪的毛蕊异黄酮葡萄糖含量明显比种植的黄芪高，秋季花茎凋枯后是黄芪采摘的最好季节，因此，根据中药特点去采摘才能更好利用中药的宝贵资源。

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）［S］．2010年版．北京：化学工业出版社，2010：780-781．

［2］宋瑞霞，余静，梁连升，等．甘肃黄芪异黄酮化合物对血管内皮细胞凋亡的影响［J］．兰州大学学报（医学版），2007，3（33）：43-45．

［3］赵健雄，封士兰，胡芳弟．中药材黄芪与红芪的色谱鉴别法［J］．分析测试技术与仪器，2005，11（1）：634-635．

［4］胡芳弟，封士兰，赵健雄．中药材红芪中两种异黄酮类成分的含量［J］．中药材，2003，26（9）：46-49．

［5］罗春霞，林平川，谷丽华，等．高效液相色谱法测定黄芪中毛蕊异黄酮-7-O-β-P-葡萄吡喃糖苷的含量［J］．中国中药杂志，2003，28（7）：603-605．

［6］宋健平，谢华．高效液相色谱法测定当归补血滴丸中毛蕊异黄酮苷的含量［J］．中药新药与临床药理，2004，11，（15）：417-418．

［7］涂继辉，贾凌云，孙启时．蒙古黄芪中毛蕊异黄酮的分离及含量测定［J］．沈阳药科大学学报，2006，23（11）：710-712．

［8］张军，陈汀波，陈军．HPLC同时测定补阳还阳汤中毛蕊异黄酮苷、芍药苷、羟基红花黄色素A的含量［J］．中药新药与临床药理，2009，20（4）：373-375．

［9］石子仪，鲍衷，姜勇，等．不同来源黄芪药材中毛蕊异黄酮葡萄糖苷和芒柄花素的定量分析［J］．中国中药杂志，2007，32（9）：779-783．

［10］黄月纯，尹雪，魏刚．玉屏风方饮片及汤剂中毛蕊异黄酮苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷的含量相关性研究［J］．中国实验方剂学杂志，．2008，14（6）：6-9．

［11］李翔，朱臻宇，王彬，等．HPLC-MS测定黄芪药材中3种成分的含量［J］．药学学报，2006，41（8）：793-796．

［12］张曦，孙衍国，张峰，等．中药黄芪中异黄酮苷类化合物的高效液相色谱-串联质谱分析［J］．精细化工，2005，22，：888-890．

［13］陈巧霞，韩乐，刘训红，等．HPCE同时测定黄芪饮品中3种指标成分的含量［J］．南京中医药大学学报，2012，28（3）：275-278．

Determination of Calycosin-7-glucoside in Buzhong Yiqi Pills by HPLC

L iu Fuying1Dou W enyuan2Tan Xiulian1
（1 Guangdong Hospital of Traditional Chinese M edicine,Guangdong Province,Guangzhou,510120,China；2 Guangdong Key Laboratory of Emergency Chemical Test,China National Analytical Center,Guangdong Province,Guangzhou,510070,China）

Objective To establish HPLC method for determination of BuzhongYiqi pills of Calycosin-7-glucoside content．MethodsWelch C18（4．6mm×250mm，5μm）was used，the mobile phase was a mixture of water-acetonitrile as mobile phase with gradient elution with the flow rate was 1.0ml／min，260nm as the decection wavelength and column temperature was 35℃．ResultsSalidroside showed good linear relationship at the range of 19.2μg／ml to 392μg／ml（r＝0.9998，n＝6）．The average recovery was 96.5%（n＝6），RSD＝0.97%（n＝6）．ConclusionThe method appeared to be simple，convenient and precise，and can be used for control of BuzhongYiqi Pills．

HPLC；BuzhongYiqi pills；Calycosin-7-glucoside

10.3969／j.issn.1672-2779.2013.23.117

：1672-2779（2013）-23-0160-02

苏 玲

2013-10-25）