2013年清水县牛口蹄疫抗体水平的检测与分析

2013-03-10吴小娟李宏喜张婷婷单有全

中国牛业科学 2013年6期

吴小娟，李宏喜，张婷婷，单有全

（1.甘肃省清水县畜牧兽医局，甘肃清水 741400；2.甘肃省清水县红堡镇动物疫病防控与畜牧技术服务中心，甘肃清水 741400；3.甘肃省清水县黄门乡动物疫病防控与畜牧技术服务中心，甘肃清水 741400）

吴小娟1，李宏喜1，张婷婷2，单有全＊3

口蹄疫（foot and mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起，多种偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度传染性疫病。口蹄疫病毒具有多型性、易变性的特点。根据其血清学特征，现已知有7个血清型即A、O、C、南非1、南非2、南非3及亚洲Ⅰ型［1］其病理特征是患病动物口腔黏膜以及蹄部和乳房皮肤等处发生水泡和溃烂。本病被世界卫生组织（WHO）列为A类动物疫病之首，被我国农业部列为一类疫病。是我国重点防御的疾病。

近几年，口蹄疫病毒造成的危害时有发生，已造成了相当大的经济损失并直接威胁到人类生命及公共卫生安全。免疫疫苗是我国采取的主要措施之一。为了防控重大动物疫病的发生和传播，全国各地相继进行牛口蹄疫疫苗免疫接种工作。同时，通过实验室检测手段掌握疫苗免疫后畜体内产生的抗体水平是否具有保护作用，并对免疫失败个体进行补免，最大程度提高疫苗免疫保护作用，确保牲畜健康生产。在本地区抽取885份被免牛的血清进行抗体检测，以便了解抗体水平变化规律。并将获得的血清学检测资料进行分析。结果通报如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要仪器 96孔110°反应板、微量移液器、震荡器、H－25型离心机、DK－8AD型定热恒温水槽。

1.1.2 血清实验采用血清来自清水县13乡镇，实验份数为885份，血液采集时间一般在接种后20 d左右。

1.1.3 试剂口蹄疫O型免疫抗体正向间接血凝诊断试剂，口蹄疫O型正向血凝抗原，阴性血清，口蹄疫O型阳性血清，稀释液。（生产厂家：中国农科院兰州兽医研究所）。

1.2 试验方法

1.2.1 抗原标定操作方法：以《2008动物防疫新技术标准规程与管理法规手册》为依据进行抗原标定［2］。

1）用微量移液器向V型微量反应板（110°）每孔分别加间接血凝诊断试剂25μL。

2）换一吸头吸取25μL抗原液，加于第1孔的间接血凝诊断试剂中，并用移液器挤压15～20次使液体混和均匀，然后取25μL移入第2孔，混匀后取25μL移入第3孔，依次倍比稀释到第11孔，第11孔中液体混匀后从中吸出25μL弃去。第12孔不加抗原，作对照（详见表1）。

3）换一吸头吸取1%红细胞悬液依次加入1～12个孔中，每孔加25μL。

4）加样完毕，将反应板置于微型振荡器上振荡1～2min，室温（18～20℃）下作用45min，观察结果。

结果判定：参照黄创科等［3］的判断方法，观察反应混合液，根据出现凝集的程度：红细胞平铺孔底，呈倒状的伞状，边缘有卷起的趋向，特别显著者判为：＋＋＋＋（100%）；次之：＋＋＋（75%）；凝集清楚可见：＋＋（50%），再次之（25%）；阴性是血球沉于孔底中心，呈纽扣状。将板倾斜，观察红细胞有无凝集，及其凝集状态。血凝达50%以上的抗原最高稀释倍数代表一个血凝单位［4］。

（注：该标准是以畜流感抗体间接血凝试验抗体效价≥25判为合格为依据的［4］）

1.2.2 间接血凝（HI）试验以《口蹄疫防治技术规范》［5］为依据进行间接血凝（HI）试验。

制备4个血凝单位的抗原液：根据HA试验结果，确定抗原的血凝价，用间接血凝诊断试剂液稀释，使之含4个血凝单位的抗原。稀释倍数按下式计算：

表1 抗原标定试验操作术式

操作方法：①用微量移液器加间接血凝诊断试剂，1～11孔各加25μL，第12孔加50μL；②换一吸头取待检血清25μL置于第1孔的间接血凝诊断试剂中，挤压15～20次混匀，吸出25μL放入第2孔中，然后依次倍比稀释至第10孔，并将第10孔的液体混匀后取25μL弃去。第11孔加入25μL口蹄疫H5HI血清做对照，第12孔为间接血凝诊断试剂对照（详见表2）；③用微量移液器吸取稀释好的4个血凝单位的抗原液，向1～11孔中分别加25μL。然后，振荡1～2min，室温（18～20℃）下放置30min；④取出血凝板，用微量移液器向每一孔中各加入1%红细胞悬液25μL，再将反应板置于微型振荡器上振荡1～2min，混和均匀；⑤将反应板置室温（18～20℃）下作用40min，观察结果。

表2 间接血凝试验操作术式

1.3 结果判定

阴性对照血清1∶32孔、稀释液对照孔均应无凝集，阳性血清1∶2～256各孔应出现“＋＋至＋＋＋＋”凝集为合格［5］。

在对照孔合格的前提下，再观察待检血清各孔以呈现“＋＋”凝集的最大稀释倍数为该份血清的抗体效价，以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。只有阴性对照孔血清滴度不大于23，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于24判定HI试验阴性。

以H5的间接血凝（HI）效价达到25及以上为合格［6］。接种口蹄疫疫苗的免疫抗体效价达到1∶32为免疫合格［6］，有抗口蹄疫病毒感染的能力，低于1∶32时应接种疫苗。70%血凝集为该份血清的最高抗体效价判为合格。

根据农业部《2008年高致病性禽流感和口蹄疫等重大动物疫病免疫方案》的相关规定，口蹄疫免疫21d抗体效价≥32（25）且合格率必须≥70%为免疫合格［7］。

2 结果

2.1 间接血凝试验结果

清水县13个乡镇牛口蹄疫抗体的血清学检测结果如表3所示。在检测的阳性结果中，清水县牛口蹄疫O型最高抗体滴度为256（28），主要分布在红堡镇、永清镇2个乡镇；HI最低抗体滴度为8（23），主要分布在远门乡、新城乡2个乡镇。清水县总体血清抗体阳性率为79.38%，血清抗体阳性率以永清镇和红堡镇最高，达89.61%和88.64%，血清抗体阳性率以远门乡最低，为68.75%；永清镇、白沙乡等11个乡镇牛口蹄疫O型疫苗的免疫合格，远门乡1个乡镇未达到标准，其余各乡镇抗体水平均处于70%～90%之间。其中，六个乡镇在70%～80%之间，五个乡镇在80%～90%之间。从分布来看，偏僻地方的口蹄疫抗体效价普遍偏低，应加强免疫。

表3 2013年清水县13乡镇口蹄疫抗体血清学检测结果

3 分析与讨论

3.1 抗体效价

从总体监测结果来看，清水县的口蹄疫免疫抗体效价水平总体水平较高，保持在70%～80%左右，基本达到农业部《2008年高致病性畜流感和口蹄疫等主要动物疫病监测方案》中规定的口蹄疫抗体效价以大于等于32为合格，且合格率大于等于70%的总体要求［8］。说明清水县家畜口蹄疫强制免疫密度大，效果较好。2013年以来，虽然本地家畜饲养量大、交易频繁，但未发生一例口蹄疫疫情，更说明了免疫工作对于预防口蹄疫疫情的极端重要性。

虽然清水县的口蹄疫免疫抗体效价水平总体水平较高，但是还有部分乡镇免疫率较低，究其原因，有以下几种可能①打飞针，注射浅。疫苗的注射部位不准确、剂量不足。抽针时也存在疫苗回流耗损现象，导致有效注射剂量不足；②免疫密度未达到要求。病畜、瘦弱畜、临产畜、幼畜等不能注射疫苗，而此次防疫在2月底3月初进行，部分牲畜处于临产期而未注射疫苗；③疫苗保存及运输要求在2～8℃环境下，避光保存，使用过程中未完全按照要求操作，影响了疫苗质量；④口蹄疫疫苗放置时间过长，容易出现沉淀，在使用前应摇匀。疫苗注射14～21 d后动物机体产生免疫抗体，在未产生抗体或抗体才开始产生水平不高时采集血清会影响到抗体效价；⑤各种应激，如药物干扰、疾病感染以及抗原间相互反作用等都可能影响机体免疫球蛋白的产生；⑥一针多用在注射时不换针头，个针头注射多头牛。如果遇到带毒牛或有传染病的牛，会传染其它的牛，所以注射头牛后要换个针头；⑦家畜自身的原因，个别牛在注苗后没有产生免疫力。另外，抗体变化中的反弹现象对抗体上升与下降规律的影响，在指导监测的时间及对监测结果的分析过程中，也会引起效价波动［9］。

4 预防

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄动物一种急性、烈性、高度接触性传染病，对人类也有一定的感染性。口蹄疫的流行给世界畜牧业造成极大危害和巨大经济损失，同时也成为影响人类公众卫生健康的重要源头之一，口蹄疫的危害在于其传播途径多，传染性强，近年来，在我国相继发生流行，严重影响了畜牧业的发展和动物及动物产品的国际贸易。国际兽医局（OIE）将其列为A类传染病首位，我国也将其列一类传染病。为了尽快扑灭此病，国家对口蹄疫实行强制免疫。

做好口蹄疫的预防工作，不仅对促进清水地区畜牧业的发展，而且对搞好全县公共卫生事业都具有重要意义，不可忽视。方法有：①一般措施：加强饲养管理，保持畜舍卫生，经常进行消毒，对购进动物及产品、饲料、生物制品等进行严格检疫，平时减少机体应激反应；②预防接种：适时对健康畜进行注射口蹄疫灭苗。每头牛肌肉注射5mL，必要时加量注射。注射半个月后产生免疫力。每年免疫2～4次，同型保护一年；③消毒：粪便进行堆积发酵处理或用5%氨水消毒，畜舍、场地和用具以2%～4%烧碱液、10%石灰乳、0.2%～0.5%过氧乙酸或1%～2%福尔马林喷洒消毒，毛、皮张用环氧乙烷、溴甲烷或甲醛消毒，肉品以2%乳酸或自然熟化处理。

［1］孙振云，金珊.正向间接血凝试验在检测口蹄疫抗体中的应用［J］.畜牧与饲料科学，2007，（02）：70.

［2］王冬宝，张松.牛口蹄疫免疫抗体实时跟踪监测分析报告［J］.当代畜牧，2006，（9）：19－20.

［3］黄创科，托建东，骆志强，等.口蹄疫免疫抗体效价的测定及结果分析［J］.农村科技，2007，（7）：69.

［4］袁立岗，蒲敬伟，李岩，等.口蹄疫二价灭活疫苗免疫效果观察［J］.当代畜牧，2007，（3）：16－19.

［5］陈九.高致病性禽流感防治技术规范等8项国家标准发布实施［J］.中国标准化，2004，（3）：77.

［6］田生花，何成伟.血凝试验监测家畜O型口蹄疫免疫抗体［J］.现代农业科技，2008，（14）：202－207.

［7］中国农业部.2008年高致病性禽流感和口蹄疫等重大动物疫病免疫方案［J］.中国牧业通讯，2008，（4）：2.

［8］谢海燕，赖笑娴，朱燕秋，等.口蹄疫间接血凝试验与ELISA试验结果的相关性探讨［J］.中国兽医杂志，2008，（6）：30－31.

［9］刘颖，冉多良，马扬，等.正向间接血凝试验监测家畜O型口蹄疫抗体［J］.现代农业科技，2007，（19）：49－51.

S823.2

1001－9111（2013）06－0084－03

2013－08－14