细胞色素P450 3A5基因多态性与原发性高血压的相关性

肖 飞，邱 健，钟国强△，曾志羽，涂荣会，何 燕，李 烁

（1.广西医科大学第一附属医院心血管病研究所，南宁530021；2.广州军区广州总医院心血管内科 510010）

原发性高血压（essential hypertension，EH）作为一种病因未明的多基因多因素疾病，是个体的遗传易感性和环境致病因子共同作用的结果。国内外研究已发现数十种基因与EH相关。细胞色素 P450（cytochrome P450，CYP）超家族包括CYP1～4 4个家族和A、B、C、D、E亚家族及数十种同工酶，参与各种内、外源性物质的代谢，对某些疾病的发生发展也有重要影响。其中CYP3A酶类参与皮质醇和皮质酮的新陈代谢，使其转化为6β-羟基皮质醇和6β-羟基皮质酮，其活性与血压相关［1］。CP3A5是CYP3A家族中重要的亚家族，是人类肾组织中主要的CYP3A表达酶，肾脏内CYP3A介导的酶活性依赖于CYP3A5基因型［2］，且其与肾脏近端小管钠的重吸收有关［3］。因此其本身所具有的遗传多态现象导致CYP3A酶类活性不同及CYP3A5表达差异，进而影响内源性皮质醇的新陈代谢作用，可能最终通过影响钠的重吸收而影响血压。本研究旨在检测EH患者和对照者的CYP3A5＊3（6986A＞G）位点多态性，分析其与中国汉族人EH之间的关系，及对血压的影响，寻找与EH有关的可能遗传标记。

1 资料与方法

1.1 一般资料 所有研究对象均从2011年10月至2012年6月本院老年心血管内科住院患者及健康体检人群中选取。（1）EH组：参照1999年WHO／ISH高血压指南的诊断标准，收缩压（SBP）≥140mm Hg和（或）舒张压（DBP）≥90mm Hg；或者既往有高血压病史，正在服用降压药物；其中男119例，女51例，年龄（63.05±10.54）岁。（2）对照组：符合SBP＜140 mm Hg、DBP＜90mm Hg，排除既往高血压史，其中男109例，女84例，年龄（58.18±12.62）岁。流行病学调查内容包括：吸烟史、血压以及临床一般生化指标的测定。所有研究对象均为自然人群，汉族且无血缘关系，均排除继发性高血压，排除肝、肾、肿瘤、糖尿病等其他严重的全身性疾病。

1.2 方法

1.2.1 人的基因组DNA提取 于清晨采集EH患者和对照者外周静脉血5mL，置于乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝管中保存于-70℃超低温冰箱中以备提取DNA。将储存抗凝血按人血液DNA提取试剂盒操作步骤提取白细胞基因组DNA，DNA提取试剂盒为Tiangen公司人血／细胞／组织DNA提取试剂盒，所提取的DNA于-20℃保存。

1.2.2 引物和Taqman MGB探针设计 根据GenBank收录的CYP3A5基因家族，查找CYP3A5＊3等位基因序列，通过BLAST对比，针对CYP3A5＊3等位基因保守序列设计引物和TaqMan MGB探针。引物F为：AAT GCT CTA CTG TCA TTT CTA ACC ATA ATC，引物R为：TCA CAC AGG AGC CAC CCA A，探针1（G）为：FTG TCT TTC AGT ATC TCT TP，探针2（A）为：6TGT CTT TCA ATA TCT CTT CP（F代表FAM，6代表HEX，P代表MGB基团）。以上均由上海基康生物技术有限公司合成。

1.2.3 实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测 对CYP3A5基因目的片段进行PCR扩增及SNP分型。RT-PCR反应体系（25μL）最终成分为：模板DNA 1μL、Master MiX酶12.5μL，引物各1μL，探针各0.5μL，灭菌双蒸水8.5μL。在Rotor-Gene 6000RT-PCR仪上反应：95℃预变性5min，然后95℃变性30s，60℃退火延伸1min，仪器同时收集荧光信号，共进行40个循环。软件分析得出SNP分型结果。

1.2.4 测序验证SNP分型结果 将DNA模板抽样共10例，经PCR法对CYP3A5基因目的片段进行扩增。引物序列参考文献［4］设计，上游引物为：5′-CAT GAC TTA GTA GAC AGA TGA C-3′，下游引物为：5′-GGT CCA AAC AGG GAA GAA ATA-3′，由上海英骏生物技术有限公司合成。10×PCR buffer、rTaqDNA聚合酶、dNTP等试剂由TaKaRa公司生产。扩增产物为293bp片段，建立50μL反应体系：10×PCR buffer 5μL，Takara Tap 0.25μL，2.5mmol／L dNTP 4 μL，10.0μmol／L的上下游引物各4μL，模板DNA 4μL，灭菌双蒸水补至50μL；扩增循环参数：94℃预变性7min，然后94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸7min。PCR产物送至上海英骏生物技术有限公司直接测序。

1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。计量资料以±s表示，t检验，χ2检验用于计数资料的关联分析和Hardy-Weinberg平衡检验，应用logistic回归分析法进行多因素回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般临床特征比较 两组间尿素氮、血糖、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。EH组年龄、SBP、DBP、三酰甘油（TG）水平明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），而高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

表1 高血压组与对照组临床资料比较（±s）

表1 高血压组与对照组临床资料比较（±s）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，与对照组比较。

项目 高血压组（n＝170） 对照组（n＝190）58.18±12.62 SBP（mm Hg） 143.83±16.38b 120.70±11.14 DBP（mm Hg） 80.64±11.29b 72.47±9.26尿素氮（mmol／L） 5.67±2.75 5.38±1.62血糖（mmol／L） 5.37±0.92 5.16±0.96 TC（mmol／L） 4.68±0.99 4.68±0.80 LDL-C（mmol／L） 3.01±0.86 2.92±0.65 HDL-C（mmol／L） 1.06±0.28b 1.20±0.34 TG（mmol／L） 1.78±0.93a年龄（岁） 63.05±10.54b 1.55±0.83

2.2 CYP3A5基因扩增目的片段的Taqman MGB PCR体系分型结果 本实验Taqman MGB探针1的5′端标记FAM，通过绿色通道检测G碱基，探针2的5′端标记HEX通过黄色通道检测A碱基，3′端标记不发光的粹灭基团并连接 MGB基团。当黄色通道未检测到荧光信号，绿色通道检测到荧光信号，表现为GG纯合型；当绿色及黄色通道均检测到荧光信号，表现为GA杂合型；当绿色通道未检测到荧光信号，黄色通道检测到荧光信号时，表现为AA野生型；运用Taqman MGB探针法，所有研究对象的CYP3A5基因扩增目的片段均得到满意SNP分型结果，获得3种基因型：GG纯合突变型（CYP3A5＊3／＊3）、GA 杂合突变型（CYP3A5＊1／＊3）、AA 野生型（CYP3A5＊1／＊1）。

2.3 CYP3A5基因扩增目的片段的测序结果 抽样测序的10例DNA模板PCR产物均得到满意扩增。10例样本测序结果与Taqman MGB分型结果一致。检测到2种基因型：GG纯合突变型（CYP3A5＊3／＊3）、GA 杂合突变型（CYP3A5＊1／＊3），未检测到 AA野生型（CYP3A5＊1／＊1）。

2.4 CYP3A5＊3（6986A＞G）多态性位点基因型分布频率及等位基因频率分布 两组CYP3A5＊3（6986A＞G）基因型和等位基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。EH组 GG、GA、AA基因型频率分别为51.2%、42.4%、6.5%，而对照组则为39.9%、50.8%、9.3%；EH 组 GA＋AA基因型频率低于对照组，差异有统计学意义（χ2＝4.643，P＝0.031），通过相对危险度分析发现，GG基因型者EH的患病风险是GA＋AA基因型者的1.579倍，见表2。等位基因频率分布在两组间相比也有统计学差异，EH组A等位基因频率分布低于对照组（χ2＝4.192，P＝0.041），见表3。

表2 CYP3A5＊3基因型分布频率

表3 CYP3A5＊3等位基因分布频率

2.5 EH危险因素的非条件Logistic回归分析 以有无高血压为因变量，将性别、年龄、吸烟、TC、LDL-C、HDL-C、TG、基因型引入Logistic回归模型。结果显示，基因型（GG）是EH的一项独立危险因素，见表4。

2.6 CYP3A5＊3各基因型间血压水平的比较 以基因型分组，比较分析发现EH组GG基因型者SBP（143.60±17.12）mm Hg和DBP（79.54±11.12）mm Hg与GA＋AA基因型者SBP（144.06±15.75）mm Hg和 DBP（81.72±11.43）mm Hg相比，差异无统计学意义（P＞0.05）；对照组GG基因型者SBP（122.82±11.82）mm Hg和DBP（73.12±9.70）mm Hg与GA＋AA 基 因 型 者 SBP（119.37±10.54）mm Hg 和 DBP（72.07±9.00）mm Hg比较，差 异 也 无 统 计 学 意 义 （P＞0.05），但可以发现GA＋AA基因型者存在稍低的SBP水平。

表4 高血压危险因素的Logistic回归分析

3 讨 论

CYP3A5是CYP3A亚家族中主要的酶系，它的表达及活性有着很大的个体和种族差异，这种差异与其单核苷酸多态性有关，是造成CYP3A代谢的外源性及内源性物质差异的最重要因素。目前在已经发现的30多种CYP3A5突变型中，位于第3号内含子的6986A＞G突变最具功能意义，它导致mRNA的剪接发生改变以及蛋白质截短，使得应至少携带一个CYP3A5＊1（A）等位基因，才能在体内转录完整的CYP3A5mRNA及表达，而携带基因为CYP3A5＊3／＊3（GG）的不表达CYP3A5［5］。CYP3A5＊3的基因频率存在明显的种族差异，在白种人中的分布频率为70%～85%，在黑人中为27%～50%，在亚洲人中为65%～85%［6］，在中国汉族人中为72.7%［7］。

研究提示CYP3A5基因多态性与EH的发病具有相关性，但研究结论不一。最初在高血压大鼠模型实验中发现，CYP3A活性的增加能增强6β-羟基类固醇的生成，导致高血压［8］。在人类所进行的相关研究中，Givens等［2］首先发现了CYP3A5＊1等位基因型个体与CYP3A5＊3等位基因型个体比较拥有较高的SBP、平均动脉压和内生肌酐清除率。随后Herbert等［9］在黑种人的研究中，发现CYP3A5＊1等位基因可能与EH的发病具有相关性。在关于白种老年人的研究中，发现CYP3A5＊1／＊3表达子显著高的出现在高血压组［10］。而Lieb等［11］及 Langaee等［12］的研究发现，CYP3A5＊1等位基因对血压无明显影响，与高血压发病不具有相关性。Reinhold等［13］的研究结果提示携带CYP3A5＊1等位基因者存在较低的SBP及脉压水平。Fromm等［14］在青年白种人的研究中发现，CYP3A5＊3／＊3基因型者比＊1／＊3者拥有显著升高的24h动态收缩压值。最近Zhang等［15］在对238例日本男性的研究中发现，CYP3A5＊3／＊3基因型者的SBP和DBP与其盐的摄入水平显著相关。Xi等［16］经 Meta分析得出，在白种人中CYP3A5＊1等位基因携带者拥有低的SBP。本实验通过对170例EH患者和193例对照者CYP3A5＊3基因多态性分析，发现高血压组GA＋AA基因型分布频率低于对照组，GG基因型者EH的患病风险是GA＋AA基因型者的1.579倍，同时高血压组A等位基因频率分布也低于对照组。提示A（CYP3A5＊1）等位基因可能降低EH的患病风险，与Reinhold等［13］的研究结论基本相符。与在高血压大鼠模型试验［8］中得出的结论不一，考虑可能人类肾脏CYP3A5同工酶的表达模式与大鼠不同［17］，同时，要比较人类与大鼠肾脏内所有的CYP3A酶类的活性与功能比较困难。也与Givens等［2］的研究结论不符，可能与人种、性别、年龄等混杂因素，以及高血压在不同种族或民族中发病机制的不同，基因型及等位基因频率的分布状况，以及基因多态性对该基因转录表达水平的影响在不同种族间的差异、血压水平的被动性、环境和遗传因素的相互作用等多种影响因素有关。另外对照组GA＋AA基因型者存在稍低的SBP水平，与 Reinhold等［13］、Xi等［16］研究结论类似。此外本研究中对照组CYP3A5＊3等位基因频率为65.3%，低于Li等［7］报道的中国人CYP3A5＊3等位基因频率72.2%，可能是本研究中对照组研究对象均为年龄较大的非EH患者，也可以从侧面说明CYP3A5＊1（A）等位基因可能对原发性高血压具有保护作用。

原发性高血压的发生受遗传、环境等多因素的相互影响，而基因多态性存在种族、民族及地域间的差异，CYP3A5＊3基因多态性与原发性高血压之间是否真正存在相关性，是通过影响SBP还是DBP的水平而影响原发性高血压的发病，是否与盐的摄入水平相关等等，目前尚无定论。本研究结果仅仅是一个提示，但也不能完全排除由于样本数量和选择偏倚而产生的差异，因此今后的研究需要进一步进行大样本研究，以及研究EH纵多影响因素之间的相互作用。

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