耐高温植酸酶的热稳定性评估方法分析

■王海燕 汤海鸥 王晓睿 杨禄良 刘 影

（1.北京挑战生物技术有限公司，北京 100081；2.生物饲料开发国家工程研究中心，北京 100081）

随着畜牧业的发展和生产水平的提高，植酸酶在饲料工业中的应用越来越广泛。植酸酶即肌醇六磷酸磷酸水解酶，催化植酸水解生成低级肌醇磷酸衍生物和无机磷酸，可有效提高植物性饲料中磷的利用率，增加可利用养分的数量，可以定量地替代无机磷饲料。由于植酸酶催化效率高，很小的添加量就能替代几十倍至百倍以上的磷酸氢钙或骨粉，为饲料配方设计节省出了宝贵的空间，降低饲料成本，提高饲料消化率，改善动物的生产性能，减轻畜禽排放磷对环境的污染，其添加效果日益得到各方面的认可。

植酸酶应用大多以干粉粒的形式在饲料加工调质和制粒之前添加，而酶在制粒的过程中所处的环境是高温蒸汽，活力损失较大。目前，制备耐高温植酸酶的主要方法有：①筛选能够产耐高温植酸酶的微生物基因(自然基因或者改造基因)及其相应的生产菌种；②采用包被、微囊化等剂型技术提高耐温性[1-2]。前者是酶蛋白分子本身具有较高的热稳定性，故效果最佳，而后者因为成本、包材影响释放等原因在实际使用中存在一些弊端。这两种类型的耐高温植酸酶都在市场上有售，因为没有统一的、公认的评判标准，各家产品的热稳定性也是众说纷纭。本文综合目前评估植酸酶热稳定性的方法[3-5]及我们的实际检测情况作一介绍，以便为植酸酶的热稳定性评估提供参考依据。

1 实验室评估植酸酶热稳定性的方法

1.1 水浴法

按照国标法操作，将固体植酸酶溶解释放到缓冲液中，取一定体积一定稀释浓度的溶液到玻璃试管中，将玻璃试管放到已经达到目的温度的水浴锅中保温一定时间后测定酶活力[5]。该方法是通过调节水浴锅中水温和水浴时间来反映温度对植酸酶活性的影响，方法简单、操作方便。在水浴处理过程中，酶蛋白分子是完全暴露在高温的水环境中，与实际制粒条件差别很大，当体系中含有大量的自由水时，就会破坏酶分子内部的氢键，而氢键在维持酶的空间构象中起着重要的作用，因此酶分子构象容易发生变化，酶就易于变性失活。

水浴法评估植酸酶热稳定性时要注意两个问题：一是水浴法适合于评估酶蛋白分子本身具有热稳定性的植酸酶产品，不适合于评估包被型植酸酶的耐热性。水浴法将植酸酶溶解释放出来实际上就是去除了包被材料的保护作用，无法反映出后处理工艺对热稳定性的影响。二是热处理时酶液浓度对保存率有影响。在固体酶的溶解释放过程中，释放出的不仅有酶蛋白分子，还有其他离子，稀释倍数不同则这些离子的浓度也不同，因而离子强度不同。蛋白质所处环境中的离子强度能够影响其空间结构，功能与结构密切相关。为了验证此观点，进行了以下试验论证。

取0.208 6 g植酸酶样品，溶于约80 ml缓冲液中，25 ℃、250 r/min震荡30 min，定容至 100 ml，取一定体积的溶液于4 000 r/min离心10 min，取上清得原酶液，分别测定原酶液、原酶液80℃保温3 min、原酶液稀释至 1/50再80℃保温3 min的酶活力，结果见表1。

表1 不同热处理浓度对酶活保存率的影响

从上面试验结果可以看出，同一个样品，热处理时不同的酶溶液浓度可导致不同的保存率。因此面对不同来源的数据，比较不同产品的保存率时一定要慎重。

在实际采用植酸酶国标GB/T 18634—2009进行测定过程中，我们一般认为实测吸光值A-A0在0.2～0.5范围内数据为可采用数据。若超出此范围，则需相应地调整稀释倍数，重新测定，即调整试样溶液的浓度在0.4 U/ml左右。因此在进行热评估过程中，我们统一热处理的浓度为测定浓度的10倍，即试样溶液的浓度在4 U/ml左右，对多数植酸酶产品而言，如果保存率不低于10%即可适当的稀释进行酶活测定。

1.2 干热法

干热法是将植酸酶样品在恒温干燥箱里直接处理一定时间，然后测定植酸酶保存的活性[6]。通常酶在非常干燥的情况下，构象比较稳定，具有一定的耐热性。因干热法的条件与实际制粒条件差异太大，又不像水浴法那样将酶蛋白分子置于苛刻的条件下反映出酶本身的热稳定性，用干热法得到的酶的保存率都偏高，参考意义较小，因此实际中应用得相对较少。

1.3 湿热法

湿热法即模拟制粒法，是干热法基础上进一步考虑调质和制粒时湿度因素，使得在方法学上实验室评价调质和制粒加工对植酸酶活性的影响更接近实际调质和制粒条件[6]。颗粒饲料制粒过程中酶制剂经历的是高温、高湿和高压的环境，湿热法模拟的是高温、高湿的条件。

本实验室的具体操作是：①测玉米面实际含水率；②取一定量植酸酶与玉米面混合均匀，调水分到16%。植酸酶因比例小水分可忽略；③将上述混合物放入已达目的温度的干燥箱中，保温一定时间后取出自然冷却至室温；④测酶活力。在实际操作过程中，步骤②因手工操作很难混合均匀，取样检测湿热处理前的酶活时变异系数很大。虽然可以根据植酸酶与玉米面的混合比例计算出混合物中植酸酶的理论酶活，但我们的经验是理论值和实测值是有差异的。为了解决混合不均匀对试验结果的影响，我们采取的措施是步骤②精确平行称量两份植酸酶样品分别与玉米面混合，一份全部混合物用于测定湿热处理前的酶活力，另一份热处理后全部抽提测定酶活力。通过这一具体操作上的调整，较好地解决了因混合不均匀导致的结果变异大的问题。

实践证明，经干热法和湿热法评估得到的耐高温植酸酶的保存率均比水浴法和实际制粒法的高，本实验室中通常采用水浴法快速评估植酸酶的热稳定性，发现经75℃、5 min或80℃、5 min热处理后，不同厂家的耐高温植酸酶保存率差别比较大，建议有评估条件的用户首先用水浴法对裸酶耐高温的植酸酶产品（即非包被的耐高温植酸酶）进行初步筛选评估。

2 实际制粒条件下评估植酸酶热稳定性

无论水浴法、干热法还是湿热法来评估耐高温植酸酶的热稳定性都只能作为参考，植酸酶能否耐受制粒的条件、制粒后酶活保存率能达到多少，最具有说服力的就是实际制粒后测定的结果。实际制粒评估植酸酶热稳定性存在两个问题：一是植酸酶在配合饲料中的含量太低，误差对结果影响大；二是植酸酶因添加量小混合均匀度的问题难以解决。

植酸酶实际使用中的理论含量一般是400～500 U/kg配合饲料，而植酸酶国标法的检出下限是130 U/kg。酶活太低则测定时吸光值很低，落在了国标法标准曲线中浓度与吸光值成线性关系的范围外，检测值无法准确地反映实际值。为解决这个问题，我们将国标法标准溶液浓度稀释10倍做适用于配合饲料的标准曲线，将取样量加大到5 g定容到100 ml缓冲液中。即使这样，结果依然不理想，试验误差对检测结果的影响所占比例大。现在市场上的耐高温植酸酶常见剂型为颗粒型，添加量小，即使采用逐级稀释也很难避免混合不均匀的问题，即使混合均匀了，因测量取样量少而加大了数据变异。下面以本实验室检测的一组样品的原始数据来说明这个问题，见表2。

表2 加酶饲料的检测原始数据

样品A3T检测了4次，得出的4个酶活力差别很大。类似的情况多次出现在正常添加剂量的加酶饲料样品中。国标法中对重复性的描述是：同一试样两个平行测定值的相对偏差，添加植酸酶的各种饲料样品不大于15%。相对偏差=（个别测定值-算数平均值）/算数平均值，表2的连续2 d的2次平行测定，相对偏差分别达到了47.46%和100%。用这样的数据来评判制粒效果结果是不可信的。

为了解决加酶饲料酶活力测定误差影响大和混合不均匀的问题，我们设计的制粒实验方案是加大植酸酶的用量，一般是正常用量的10～20倍，各取调质后制粒前粉状饲料和制粒后颗粒饲料样品5个平行样，按照国标法检测植酸酶活力，如果相对偏差不大于15%，说明检测数据是可以采用的，结果分别取平均数。对于相对偏差大于15%的数据进行舍弃后再取平均数。这个实验方案能在一定程度上提高试验结果的可信性，但是也经常会出现数据差别大的情况。下面我们用实际检测情况为例说明这个问题。本次制粒实验植酸酶检测酶活为9 015 U/g，添加量是1.2 kg/500 kg饲料，则制粒前加酶饲料酶活力理论值是21.636 U/g，制粒前和制粒后检测结果见表3。

表3 制粒实验加酶饲料检测结果

制粒前加酶饲料的5个测定值的相对偏差均小于15%，酶活力平均值为18.112 U/g，根据植酸酶样品酶活力和添加量换算出来的酶活力理论值是21.636 U/g，说明饲料中的一些成分对测定结果有影响。制粒后5个测定值的平均数是13.08 U/g，制粒保存率为72.22%，制粒后样品1酶活力10.46 U/g和制粒后样品5酶活力15.09 U/g相对偏差分别是20%和15.4%，舍弃后平均值为13.28 U/g，制粒保存率为73.33%。制粒后样品5相对偏差15.4%，刚超出国标规定，如果数据采用，则制粒后酶活力平均值为13.74 U/g，制粒保存率为75.86%。因为数据的采用情况不同，制粒后酶活保存率可以为72.22%、73.33%或者75.86%，但是总体来说，保存率差别不是很大。本次制粒实验较好地反映出了制粒后酶活力的保存情况。

在上述制粒实验中，还有一个现象值得注意，饲料调制和制粒前的粉状饲料检测结果相对偏差均小于15%，说明植酸酶混合的均匀度比较好，然而制粒后检测有两个结果偏差大于15%，推测这种变化不仅仅是由混合均匀度导致，可能与制粒过程中调制机内部温湿度及压力不均匀有关。

影响实验结果的因素很多，如果考虑不全面很可能导致实验的失败。目前耐高温植酸酶用户最关心的问题是植酸酶制粒后能保存多少酶活，能否满足动物生产中的需要。不同饲料厂由于设备、饲料配方、加工工艺等的差异，饲料制粒过程中的调质温度、调制时间、蒸汽压力、环模孔径等参数有较大的差异。对于某一种植酸酶的耐热性评价，需要针对不同的饲料调质、制粒参数，在湿热蒸汽处理时间上要做出适当调整，使评估方法更接近于特定饲料厂生产的实际。但是评估也并非取样测定一下这么简单，实验设计是否合理，取样是否合理，取样的数量是否足够具有代表性等等，很多因素会影响到结果是否能真实地反映出植酸酶的制粒效果。

有研究表明，植酸酶能够提高蛋白质、氨基酸、能量、矿物质的利用率[7]，高剂量植酸酶显著提高肉鸡的生长性能以及表观代谢能(AME)、蛋白质、氨基酸、钙、磷的消化率。有研究表明，高剂量添加植酸酶（8 000 FTU/kg）不会对动物造成不良影响[8]。因此，考虑到正常添加量在实际检测中误差影响太大，建议客户在通过实际制粒评估植酸酶热稳定性时，加大植酸酶的剂量，一方面可以提高评估实验本身的科学性和可信度；另一方面，用于评估的饲料可以正常的使用，不会造成浪费或不良后果。

3 小结

通过实验，我们建议耐高温植酸酶热稳定性评估的方法为：

①实验室评估。水浴法，将酶溶液浓度调整到4 U/ml左右，在一定温度的水浴中保温一定时间后测酶活力。保存率（%）=热处理后的酶活/原酶活×100。②制粒评估。制粒时植酸酶添加到正常用量的10～20倍，各取调质后制粒前粉状饲料和制粒后颗粒饲料样品5个平行样进行测定。将国标法标准溶液浓度稀释10倍做适用于加酶饲料的标准曲线，按照国标法检测植酸酶活力。植酸酶保存率（%）=颗粒料植酸酶活力/粉料植酸酶活力×100。