三聚氰胺免疫亲和柱的制备和测试

徐丽广， 刘丽强， 匡 华， 彭池方， 宋珊珊， 欧阳华， 胥传来

（江南大学 食品学院，江苏 无锡214122）

2008年的“三鹿”奶粉事件导致30多万婴儿住院，是我国近年来出现的最严重的食品安全事件，严重损害了我国食品制造的国际声誉，给我国乳制品产业造成了前所未有的重大损失[1-3]。不法分子利用传统凯氏定氮检测方法的漏洞，在生乳中添加工业原料三聚氰胺来获得较高的“表观蛋白质”水平，导致劣质有害奶粉的大量生产[4]。三聚氰胺已被证实可引起婴儿肾结石，各个国家和政府组织均制订了乳制品中该物质的最大残留限量。我国规定，乳制品中三聚氰胺的质量分数不得高于2.5 mg/kg，婴幼儿乳品中的最大质量分数不得高于1 mg/kg。相应地，我国出台了三聚氰胺的标准检测方法（GB/T 22388）。目前报道的检测方法也多基于色谱和质谱的检测方法。这些方法需要复杂的前处理，从提取到净化耗费大量的有机溶剂和固相萃取小柱[5-9]。

快速高效的样品前处理技术可以大大简化和加快检测流程。免疫亲和层析柱，是基于抗体或抗原大分子的绿色前处理手段，可以集提取和净化于一身，无需大量有毒有害溶剂，而且可以多次重复使用，因而越来越受到分析人员的青睐[10-13]。作者以三聚氰胺单克隆抗体做为识别体，装填了具有高柱容量的亲和层析小柱。目前对于三聚氰胺分离富集免疫层析小柱的报道尚未看到，将为食品中三聚氰胺的检测提供了新的前处理手段。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

三聚氰胺抗体，作者所在实验室自制，半数抑制率（IC50）为6 ng/g，与三聚氰胺亲和常数为2.67×109L/mol，与除了与灭蝇胺的交叉反应为132%外，与其他三聚氰胺类似物无交叉反应。四甲氧基硅烷（TMOS）和 PEG400:购自 Sigma（上海）贸易有限公司；三聚氰胺及其他试剂:购自中国医药集团上海化学试剂总公司。

1.2 仪器与设备

电子天平AB104-N型:购自上海Metller Toledo Group；精密酸度计PHS-3TC型:购自上海天达仪器有限公司；紫外扫描仪U-3000型:购自日本岛津公司；可见分光光度计722型:购自上海分析仪器厂；高效液相色谱－质谱联用仪（LC/MS）LCQDECA型:美国非尼根公司产品；WH-2微型旋涡混合仪和HPD-25D真空泵:购自上海沪西分析仪器厂；可调试移液器:购自美国热电公司。

1.3 溶液配制

磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH 7.4）配制参考文献方法[14]。淋洗液为含质量分数0.05%Tween-20的0.02 mol/L PBS溶液；上样溶液为含体积分数10%甲醇的0.02 mol/LPBS溶液；洗脱溶液为含有体积分数50%甲醇的0.01 mol/L pH 3.5甘氨酸-盐酸溶液（称取甘氨酸7.5 g，加入12 mol/L HCl 10 mL，甲醇500 mL，纯水定容至1 000 mL）。再生液为含质量分数0.05%Tween-20的0.01 mol/L的PBS溶液。

三聚氰胺标准溶液配制:称量0.1 g的三聚氰胺药品，用磷酸盐缓冲液溶解定容至1 000 mL，即为100 μg/mL的标准溶液。用上样缓冲液将100 g/mL的标准溶液分别稀释配成质量浓度为50、25、10、5、2.5、1 μg/mL，500、250、100、50、25、10、5、2.5、1、0 ng/mL。每个质量浓度配成100 mL，置于4℃保存备用。

1.4 IAC柱制备

量取抗体溶液，用 PBS（0.01 mol/L pH 7.4）缓冲液稀释至1 mg/mL，4℃保存备用。取0.2 mL HCl（0.04 mol/L），0.75 mL 去离子水，0.2 mL PEG400 和3.4 mL TMOS混匀，在4℃放置2～3 min预冷却。然后将其放入冰水中，超声混匀30 min，量取该溶液，按照体积比1∶2的比例将其加入预冷的抗体溶液中，期间缓慢搅拌，待凝胶形成后，称取容器质量，将凝胶置于37℃恒温烘箱凝胶老化。待凝胶失去初重的50%时，老化过程结束。将老化后的凝胶（约1 g）研磨碎，能过30～40目筛即可，然后进行装柱。每个柱中装填体积为1 mL；待柱中凝胶沉积稳定后，用5 mL PBS预淋洗，洗去未包埋的抗体IgG和其他干扰杂质，最后用5 mL PBS平衡。制备好的IAC柱中保留1 mL的PBS溶液，加上塞子和盖子，在4℃环境中保存备用，长期保存需加质量分数0.02%叠氮化钠作为防腐剂。

1.5 IAC柱的评价

1.5.1 柱容量测试 取制备好的亲和层析小柱，回复至室温后，取下柱子上下端的塞子，将柱子与真空泵连接，调节流速，使柱子里面的液体以2 d/s的速度流出（流量不大于1 mL/min）。待液体排干后，将10 mL 10 μg/mL处理后的三聚氰胺溶液（溶解于上样缓冲液中）上样，流量同上。收集流出液，测定A240nm值。待液体排干后，分别用10 mL 0.01 mol/L pH 7.4 PBST，10 mL纯水淋洗小柱，流速同上。分别收集淋洗液，并测定A240nm值。然后，加洗脱液2 mL到小柱中，调节流量1 d/s（不超过0.5 mL/min），收集洗脱液，测定A240nm值。分别用10 mL 0.01 mol/L pH 7.4 PBST，10 mL 0.01 mol/L pH 7.4 PBS清洗再生小柱，收集所有滤液，测定A240nm值。 漓干后，将柱子下端用塞子密封，然后加入3 mL 0.01 mol/L pH 7.4 PBS平衡保存液，上端用塞子密封，置于4℃保存。

1.5.2 三聚氰胺紫外吸收标准曲线建立 采用紫外光谱仪，测定配制的三聚氰胺标准溶液，在240 nm下的光密度值（OD），以标准品的浓度为横坐标，不同标准品的A240nm值为纵坐标，建立三聚氰胺微克级（μg/mL）标准曲线。采用液相色谱质谱，以三聚氰胺的质量浓度为横坐标，以三聚氰胺峰面积为纵坐标，建立纳克级（ng/mL）标准曲线。根据建立的标准曲线，分别计算柱容量测试中收集的滤液中三聚氰胺的质量浓度。

1.5.3 三聚氰胺小柱回收率测试 分别上样1、10、100、1 μg/mL质量浓度的三聚氰胺溶液10 mL。按照上述方法操作小柱，收集洗脱液，分别采用紫外光谱仪和液相色谱质谱进行测定洗脱溶液，根据相应的紫外吸收标准曲线和 计算洗脱液中三聚氰胺的含量，计算回收率（公式如下所示）。

其中V1为上样体积 （mL）；C1为上样质量浓度（ng/mL）；V2为洗脱液体积 （mL）；C2为洗脱液质量浓度（ng/mL）

1.5.4 三聚氰胺小柱富集系数测试 上样10 ng/mL浓度水平的三聚氰胺溶液100 mL；用0.5 mL的洗脱液洗脱4次，分别进行洗脱液接收，然后测定每管洗脱液的A240nm，根据紫外吸收标准曲线计算三聚氰胺的含量。计算当回收率大于70%时，所需要的洗脱液总体积。

其中:V1:上样体积（mL）；V2:洗脱液体积（mL）

1.5.5 三聚氰胺小柱再生次数测试 选取3支小柱，采用500 ng/mL质量浓度的三聚氰胺溶液3 mL上样测试，收集洗脱液，测定洗脱液的A240nm，根据紫外吸收标准曲线计算三聚氰胺的含量。测定小柱的平均回收率。每天测试一次，连续测试12 d。

2 结果与分析

2.1 三聚氰胺标准曲线

2.1.1 微克级标准曲线确定 用紫外扫描仪测得微克级标准溶液（1，2.5，5，10，25，50，100 μg/mL）的A240nm值，建立标准曲线，如图1所示。y＝0.0145 x+0.023 2，线性度（R2）为 0.997 9，其中 x 为三聚氰胺的质量浓度，y为溶液的A240nm值。

图1 三聚氰胺微克级标准曲线Fig.1 Standard curve of melamine

2.1.2 纳克级标准曲线的确定 利用液相质谱测得 ng级三聚氰胺标准溶液的浓度（10，25，50，100，250，500 ng/mL）的质谱图，方法参考国家标准GB/T 22388，谱突如图2所示.

图2 纳克级标准溶液液相色谱一质谱图Fig.2 LC-MS spectrum for melamine detection

以标准品的质量浓度为横坐标，不同质量浓度标准品的面积为纵坐标，绘制出三聚氰胺的标准曲线如图3所示:标准曲线方程为y=0.115 4x+4.131 6，线性度（R2）为 0.984 2；其中 x 为质量浓度，y 为质谱峰相对峰面积。

图3 三聚氰胺纳克级标准曲线Fig.3 Standard curve of melamine

2.2 免疫亲和柱的柱容量

柱容量测试中，上样溶液滤液收集体积10 mL，淋洗液收集体积10 mL，收集洗脱液2 mL，洗涤液和再生溶液体积20 mL，根据滤液的吸光度值，采用标准曲线方程，计算各个滤液中三聚氰胺的质量浓度，将各含量用下面公式计算出柱容量:柱容量=洗脱液体积×洗脱液；计算得到柱容量为16.47 μg。

2.3 回收率

将1，10 ng/mL，100 ng/mL的上样质量浓度的三聚氰胺洗脱液进行色谱－质谱测试，根据峰面积采用ng级标准曲线y=0.115 4x+4.131 6，测定得出三聚氰胺质量浓度，根据回收率公式计算出回收率。将1 μg/mL质量水平的洗脱液，测定出A240nm值，根据三聚氰胺紫外吸收标准曲线计算三聚氰胺浓度，根据回收率公式计算出回收率如表1所示。

表1 不同质量浓度三聚氰胺样品的回收率Table 1 Recovery of melamine in different concentrations

2.4 富集系数

分别测定了4份洗脱液在240 nm下的紫外吸收值，结果如下表2所示，根据标准曲线y＝0.014 5x+0.023 2计算出三聚氰胺的质量浓度水平，并计算出回收率。从表2可知，当使用1.5 mL洗脱液时，回收率即可达到70.34%，当使用2.0 mL洗脱液时，回收率达到80%以上，根据富集系数计算公式，得出富集系数为66。在免疫亲和柱的使用过程中，研究发现适当控制滤液流速，可以保证包埋抗体对目标物质的捕获，流量控制在1 mL/min以下较好。

2.5 再生次数

表2 洗脱液中三聚氰胺质量浓度测定和回收率结果Table 2 Results of melamine level and recovery in eluent solutions

测定结果见表3。在本试验中，小柱的测试是每天使用一次，当小柱累计使用次数为5时，IAC小柱的回收率为63%，当累计使用次数为4时，回收率均高于70%。使用次数为8时，回收率均高于40%，之后再重复使用，小柱的回收率则大幅下降，10次使用后则下降至12%左右。由于抗体属于生物大分子，容易受到离子浓度、溶液pH及有机溶剂的破坏，通过再生缓冲液的使用，延长了小柱的使用寿命。

表3 IAC小柱重复使用次数测定Table 3 Detection for possible reusage of IAC columns

3 结语

采用硅烷化包埋的方法制备了三聚氰胺的免疫亲和层析柱，并对三聚氰胺免疫亲和小柱的使用性能进行了测定，小柱的柱容量为16.47 μg/柱，富集系数为66，小柱连续使用12次后，发现，使用5次后小柱的平均回收率仍然在60%以上，使用4次后平均回收率在70%以上。试验中采用淋洗液减少了潜在的非特异性吸附效应。免疫亲和小柱在样本处理时具有高度特异性，且可重复使用以及其在使用过程中不涉及到大量有毒有害溶剂的使用，有望成为样本前处理手段的发展方向。

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