体外三维肿瘤模型的研究进展

孙培鸣 综述 徐迎新，李 荣 审校

解放军总医院 普通外科研究所，北京 100853

肿瘤生物学行为及治疗方法的体外研究一般多采用肿瘤细胞系的平面培养模型(monolayer cultures)，然而实体肿瘤在体内以三维立体模式生长，肿瘤细胞不仅相互接触还与其支撑结构—细胞外基质接触[1-2]。研究表明，单个肿瘤细胞的生物学行为受直接接触的细胞和细胞外基质的影响[3]。三维模式下的细胞微环境、细胞间及细胞与基质间的相互作用能显著的影响分泌、黏附、侵袭和转移等细胞功能[4-5]。因此，尽管平面模型在肿瘤体外研究中取得了一些进展，但其不能完全反映体内实体肿瘤的真实情况。三维细胞培养模型(three-dimensional cell culture)的发展为解决上述问题提供了良好的方法。三维细胞培养模型能在体外构建与体内相近的细胞生长系统，较好地模拟体内肿瘤细胞生长的微环境，可用于肿瘤细胞生物学行为及治疗方面的研究。现对三维肿瘤模型的构建方法及主要应用进行综述。

1 构建方法

1.1 振荡法 振荡法是构建三维肿瘤模型的常用和经典方法[6]。主要包括以下几种方式：旋转管(roller tube)、振荡瓶(spinner flask)和单程回转震荡器(gyratory shaker)。该方法主要通过振荡等外来作用力阻止肿瘤细胞贴壁形成球状体，可应用于大多数的肿瘤细胞。其主要步骤为，取平面培养的肿瘤细胞，放于含适宜培养基的培养瓶中。然后在培养瓶中放入转子，或将培养瓶放在振荡器/旋转器上。再把培养瓶或振荡器/旋转器放于配有空气/CO2平衡装置的培养箱中，维持转子、振荡器或旋转器的震荡或旋转。1~3 d后悬浮的肿瘤细胞可相互聚集形成球状体，期间需部分更换培养基以维持足够的营养。待球状体达到后续实验所需大小时取出，备用。该方法优点是能够制备大量的肿瘤球状体，缺点是利用外力形成球状体，与体内肿瘤的生长情况不相符，且不同细胞形成的球状体密度和体积有较大差异。旋转生物反应器(NASA bioreactor)由震荡/旋转法发展而来，这种装置能够培养复杂的肿瘤球状体，且能自动更换培养基提供持续的营养，但因价格较昂贵使其应用受到一定限制[7]。

1.2 液态铺板法 液态铺板法也是构建三维肿瘤模型常用的方法[8-9]。琼脂、胶原等液态生物材料常用来预先铺板，包被培养皿。取平面培养的肿瘤细胞接种在包被后的培养皿上，包被材料可阻止细胞贴壁生长。几天后，肿瘤细胞相互聚集，形成大小不等的类圆形聚集体。待肿瘤聚集体形态较规则时，将其移至另一包被后的培养皿中，定期更换培养基。当达到实验所需大小时，去除形态不规则的聚集体，备用。这种方法适于在96孔板中建立三维肿瘤模型，可用于大规模高通量的筛选抗肿瘤药物。

1.3 胶滴法 胶滴法构建的三维肿瘤模型多用于抗肿瘤药物的筛选，被称为CD-DST(collagen gel droplet embedded culture drug sensitivity test)。取平面培养的肿瘤细胞，液态胶原溶液重悬。用移液管或滴管将肿瘤细胞/胶原混合液滴于培养皿，每滴约30~50μl，再将培养皿放于培养箱，胶滴凝固后添加培养基。及时更换培养基，待胶原凝胶内肿瘤细胞聚集生长形成肿瘤球后进行后续的药敏试验[10-11]。

1.4 组织工程方法 组织工程技术传统上应用于组织再生与创伤修复领域，较少用于构建体外三维肿瘤模型。组织工程领域研究表明，种子细胞植入支架材料后形成的三维结构能够比平面模型更好的模拟体内组织，特别是在模拟体内细胞间和细胞-基质间相互作用方面[12]。组织工程支架材料，如胶原、琼脂等为多孔样结构，能够为细胞黏附、细胞与支架相互作用提供巨大的表面积，还能为细胞迁徙和营养物质的渗透提供通道[13]。目前，少量利用组织工程材料的研究多集中在抗肿瘤药物的筛选方面。

2 三维肿瘤模型在肿瘤研究中的应用

2.1 肿瘤侵袭性及转移的研究 三维肿瘤模型在肿瘤生物学中的主要应用之一就是观察肿瘤细胞立体状态下的浸润和侵袭。Schor等较早利用人子宫颈癌Hela细胞、叙利亚田鼠黑色素瘤细胞和胶原凝胶建立了肿瘤立体生长模型，凝胶中肿瘤细胞生长良好，可向胶原基质中浸润[14]。近期研究中，Chignola等建立了三维肿瘤培养的数学物理模型，可定量分析测定药物及环境等因素对肿瘤细胞迁徙能力、迁徙方向及移动动力等因素的影响[15]。研究还发现，体外构建的三维肿瘤模型移植入体内也能够产生侵袭和转移。如Tang等将体外构建的三维肝癌模型植入动物体内肝脏原位，发现可形成原位肿瘤并有远处转移[16]。

2.2 肿瘤坏死及凋亡机制的研究 三维肿瘤模型中肿瘤细胞多聚集成团生长，而团块中心区域的细胞存在缺少氧气、营养物质及物质代谢、废物处理等问题。这与体内实体肿瘤中心区域细胞的病理特征相似。早期研究表明，三维肿瘤模型中细胞坏死的主要因素包括：培养基质中氧含量和营养物质的减少、pH值的改变及肿瘤坏死区域废弃物质的累积[17]。近期研究进一步证实肿瘤细胞坏死核的形成过程中并不伴有能量代谢的变化。肿瘤细胞凋亡方面的研究表明，三维肿瘤模型比平面模型表现出更高的抵抗缺氧、放疗及化疗诱导的细胞凋亡能力。Kim等构建了U251胶质瘤细胞和U87星形细胞瘤细胞三维肿瘤模型，并研究了缺氧条件下与平面模型在细胞凋亡方面的差异。实验证实三维肿瘤模型可通过上调抗凋亡蛋白BCL-2等表现出更高的抗凋亡能力[18]。放疗方面，Dangles等研究了放疗导致的细胞凋亡在膀胱癌细胞平面培养模型和三维培养模型中的差异。研究发现，三维肿瘤模型中表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)可通过激活其受体来抑制肿瘤细胞的凋亡[19]。化疗方面，Frankel等研究了化疗药物紫杉醇引起的人卵巢癌细胞凋亡在平面培养和三维培养中的不同。实验表明，在紫杉醇作用下，平面培养模型中的肿瘤细胞较多处于G2-M期，与三维培养相比有更多的细胞凋亡[20]。研究者认为这与平面培养模型和三维培养模型中细胞排列方式、细胞结构和细胞外基质的差异等因素有关。

2.3 实体肿瘤治疗方法的研究 肿瘤治疗方法的研究一般都基于平面培养的肿瘤细胞系。但是临床实践中，常发现体外研究中有效的治疗方法与患者体内实际临床疗效有较大差异，故平面模型在预测肿瘤治疗方法的临床应用方面价值有限。而三维肿瘤模型与体内实体肿瘤均呈三维立体生长，能够较好地模拟实体肿瘤的三维空间结构及肿瘤微环境。

早期研究中，Nederman和Kobayashi等证明肿瘤细胞系在三维生长模型中大多表现出比平面培养更强的抗药性，且三维肿瘤模型中肿瘤细胞对化疗药物的敏感性与体内相似[21-22]。Orlandi等比较了伊达比星和伊达比星醇在MCF-7乳腺癌细胞平面培养与三维立体培养中疗效的不同。研究发现三维模型中肿瘤细胞的耐药性与药物作用时间有关，推测肿瘤细胞耐药性的增高与三维立体排列方式导致的药物作用延迟和分布不均相关[23]。Horning等比较了阿霉素，紫杉醇和他莫昔芬3种药物在MCF-7乳腺癌细胞平面培养与三维立体培养中的不同。研究发现不同药物对肿瘤球的作用明显不同，而且相同药物在肿瘤球不同增值时期药效也不同[24]。由此可见肿瘤细胞三维生长状态可显著地改变化疗效果，建立基于三维肿瘤模型的药物筛选平台有助于发现并筛选具有临床应用价值的化疗药物。

三维肿瘤模型中肿瘤细胞呈立体状态生长，能够较好地模拟体内免疫细胞的迁移及肿瘤细胞与免疫细胞的相互作用。免疫细胞(单核细胞、巨噬细胞、T细胞等)一般以细胞悬液的形式加入肿瘤球状体培养基中，观察三维肿瘤微环境对免疫细胞迁徙、活化、成熟及杀伤等功能的影响。Spoettl等利用HT29结肠癌细胞球状体模型研究炎症趋化因子的过度表达对单核细胞迁徙的影响，发现炎症趋化因子MCP-1可诱导单核细胞迁移到肿瘤球中[25-26]。Silzle和Gottfried等利用人黑色素瘤细胞球状体研究发现肿瘤细胞产生的乳酸盐可抑制DC细胞的分化和细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T-lymphocytes，CTL)的杀伤功能[27-28]。故三维模型中肿瘤细胞的立体排列方式、细胞间及细胞与基质间相互作用导致肿瘤细胞功能的改变可影响免疫细胞迁徙、杀伤等功能，利用三维肿瘤模型可深入研究免疫细胞的抗肿瘤作用。

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