多肽类药物有关物质研究的探讨*

白海娇，王亚敏，丁 一

(1.天津市药品检验所，天津 300070; 2.中国药品审评中心，北京 100038; 3.天津药物研究院，天津 300193)

近年来，多肽类药物成为药物研发的热点，申报的多肽类新药也逐渐增多，这类新药与普通的化学药品相比，结构复杂、稳定性差，生产工艺和质量标准等方面均有所不同。

有关物质检查是控制药品安全性的重要措施。目前，多肽类药物多采用生化提取、转基因技术和固相合成工艺制备，其工艺特点决定了产物的杂质含量较高。同时多肽药物具有以下特点:①稳定性差，化学和构象不稳定性;②易被胃肠道中的蛋白质水解酶降解;③体内生物半衰期短，消除或降解迅速;④脂溶性差，不易通过生物屏障等。因此，多肽药物通常选择注射途径给药［1］，其有关物质检测更值得关注。

普通化学药物多采用HPLC、TLC 等方法检测有关物质［1］，在方法学验证时通常对药品进行强酸、强碱、光、热和氧化破坏，考查降解产物是否能与主峰(或斑点)分离［2］，而这种强制降解试验在多肽类药物的有关物质方法学研究中是不十分适用的。由于多肽类药物很不稳定，对于酸、碱、光、热等因素和微生物、金属离子、运输过程中的振动等因素均比较敏感，因此在剧烈的破坏条件下，主成分基本全部被破坏，不仅产生过多的杂质，难于与主成分完全分离，而且也无法观察主要杂质的变化情况和影响稳定性的主要因素。关于多肽类药物如何进行有关物质方法学验证，目前没有共识的方法，由于经验有限，这里仅提一点笔者不成熟的意见。

对多肽进行常规强制降解试验不可取的原因是:在实际生产、贮存条件下，主成分不会发生如此强烈的降解，因此试验结果不理想不能彻底否定检测方法的可行性。引起多肽药物不稳定的原因主要有水解、氧化、外消旋化、二硫键的断裂及重排、β 消除、凝聚、沉淀和吸附等。多肽类药物杂质检测的方法学验证，首先应考虑合成中可能产生的中间体、同系物和错肽等副产物是否可与主成分分离，并有效检出。可以采用粗品进样分析，中间体可采用外加的方法考查分离情况。对于运输、贮藏中产生、增加的杂质，可以采用适当改变药品的处方和贮藏条件的方法考查，例如采用改变酸碱度、贮藏条件的光照强度、少加或不加抗氧剂、提高贮藏温度、摇床振动、反复冻融等方法，加速多肽降解。当然由于考查条件比较温和，可以适当延长考查时间，这样即可以考查杂质检测方法的可行性，也可以对制剂的处方选择和贮藏条件的选择提供一定的帮助。

在这类药物的杂质考查时，应该有针对性的着重考查几种检测难度较大、对药物安全性有重要影响的杂质。多肽的聚合物是影响药物安全性的重要因素之一，由半胱氨酸的巯基形成的二硫键是形成二聚体、三聚体的主要共价键，对于含有一个半胱氨酸的多肽一定应考虑二聚体检测，含有两个半胱氨酸的就应该考虑三聚体甚至多聚体的检测了。由于多肽合成、提取过程中多存在变性和复性的情况，存储过程中也会有少量多肽变性聚合，因此检测高分子量物质是非常必要的。通常采用高效分子排阻色谱法(HPSEC)以亲水硅胶、凝胶为填充剂，对于已知的二聚体、三聚体应采用外标法或相对保留时间方法确定峰位。对于已知结构的大分子多肽，主峰前的杂质峰均可按高分子物质计算，但对于生化提取的多肽类制剂，由于成分复杂，结构不确定，多采用胰岛素等已知分子量的蛋白为参比物质，只检测分子量大于该蛋白的高分子物质，有时还要配合沉淀法，定性检测蛋白质。

对于合成多肽，其旋光异构体也是值得注意的问题，虽然，很多人认为固相合成极少发生外消旋化，但相关研究表明，消旋异构体还是存在的［3］。例如有资料表明肠降血糖素类似物艾塞那肽，采用SCX -HPLC检查早期批次产品的纯度仅88.0%，其中杂质［N -His1］高达9.8%。因此至少在早期的有关物质研究中，应对消旋异构体进行充分的研究。

值得指出的是，目前国内多肽药物在进行杂质检测时多采用一种色谱系统，使用最多的是反相HPLC，C18色谱柱，等度洗脱。事实上，由于反相HPLC 主要是利用待检物质在固定相和流动相中分配系数不同的原理，因此一般在等度洗脱条件下，能检出的杂质是非常有限的，极性大的物质没有保留，极性过低的物质又没有洗脱出来，因此一般降解产物复杂的多肽类药物应采用梯度洗脱方式检测［4］。多是先采用高水相的流动相洗脱，以利于主峰与类似物峰的分离，然后梯度洗脱增加有机相比例，将水溶性差的聚合物和错肽洗出。但国内常采用的纯水相与纯有机相在线梯度混合的洗脱方式是不可取的，特别是对于水相含盐量较高的流动相，由于色谱系统不稳定，容易造成杂质高估或低估。

同时由于反相色谱柱对高亲水性物质检测的局限，应采用其他色谱系统和其他类型色谱柱，如正相色谱、离子交换系统、C3和C8色谱柱等，对制备与降解产生的极性较大的分子、离子进行考查，作为有关物质研究的一部分。除对已知杂质可采用TLC 法检测外，一般不建议采用薄层色谱控制杂质。

有关物质检测方法是否能比较全面地检出杂质，并且能反映药物质量变化，物料平衡应该是重要的考量因素。无论是在稳定性研究中，还是在上述有关物质的方法学研究试验中，含量的降低应该在杂质检测中有相应的反映。但两者存在多大差距，就认为杂质检测不适用，这个问题尚没有一个明确的限度。笔者认为如果含量下降超过2%，并且两者差距超过1%，就值得进一步研究。在审评中经常见到在影响因素和加速试验中，含量下降已经很大，但有关物质却没有明显增加，提示有关物质的检测方法无法完全检出杂质，也不能控制贮藏过程中变化较大的杂质。例如某企业申报的胸腺五肽注射液，加速试验6 个月含量下降20%以上，有关物质仅由1%增加为3.5%，补充料显示由于按照国家标准检测有关物质，进样的采集时间为主峰保留时间的2 倍，而2.5 倍主峰保留时间时，有较大的杂质峰出现，并且加速试验中增加明显，而这一杂质没有计算，有关物质检测存在很大缺陷。

当然，即使采用高效液相色谱法检测含量，存在1% ～2%的误差也是合理的，因此在进行物料平衡考查时，研究者应该特别注意操作的准确，数据的重现性以及所使用的对照品质量应保持一致。但是，对于多数转基因技术制备的多肽，常采用药物效价测定法控制含量，例如干扰素采用细胞病变抑制法。其效价测定结果说明活性蛋白的含量，并且，检测结果一般允许在很大的范围内波动，因此与杂质变化没有直接的对应关系。同样，生化提取多肽常采用的UV 法和显色法，由于专属性差，供试品中酪氨酸和色氨酸的含量对检测结果有很大影响，一般其数据也不用于物料平衡考查。

应该说明的是，无论HPLC 法的含量测定，还是有关物质检测，都是只能区分多肽一级结构的检测。多肽的二级结构与溶剂、pH 和温度有密切关系，如果空间构象改变而形成的非活性肽，其理化性质(如溶解性)变化不明显，这些检测方法经常是不能区分的。因此，至少在研制初期，进行效价测定是很有必要的，研究比较深入后，可以取消生物检测法。例如，初期胰岛素制剂均采用小鼠血糖检测法计算效价，但目前胰岛素基本都采用HPLC 法控制含量，质量比较稳定。

总之，由于多肽类药物结构的复杂性和不稳定性，其质量控制风险比较大。同时，作为药物研发的新热点，其有关物质检测的很多问题都处于探索阶段，例如杂质检测方法学验证的合理性、免疫原性杂质的检测与定量等问题，在这种情况下，有时可以采用药理学检测项目进行补充，比如异常毒性、降压物质等实验都是经常采用的。

1 孔英梅，杨伯群.新药有关物质检查中的一些问题［J］. 中国新药杂志，2000，9(7):462

2 中国药典［S］.二部. 2010:附录194，附录204

3 康健磊，徐冰珠，李建宇，等.关于合成多肽药物中非对映异构体杂质的研究［J］.中国现代应用药学，2010，27(5):387

4 王鹏.合成多肽药物结构确证和质量研究［J］. 中国新药杂志，2009，18(24):2302