人泛素－核糖体蛋白27a原核表达载体构建及表达＊

曾 涛，何 德（广东医学院医学检验学院，广东东莞 523808）

泛素－核糖体蛋白S27a（UBRPS27a）是泛素和核糖体蛋白的融合蛋白，由RPS27A基因编码[1]。核糖体蛋白S27a（RPS27a）为核糖体40S亚基组成蛋白之一，除参与蛋白质合成外，还具有其他重要功能。RPS27A基因在多种活性增殖细胞中高度表达，其过表达是肝癌、胃癌、结肠癌等多种恶性肿瘤的典型特征，很可能是恶性转化细胞或肿瘤组织的标志物，但其在肿瘤细胞中的功能作用及其分子机制尚未清楚[2－5]。本研究以原核系统表达人UBRPS27a，旨在为进一步研究其结构与功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 原核表达载体pGEX4T－1、人急性早幼粒细胞白血病HL－60细胞株、大肠埃希菌JM109及BL21（DE3）由广东医学院生物化学与分子生物学研究所保存。Taq DNA聚合酶、限性内切酶BamHⅠ和SmaⅠ、DNA T4连接酶、DL2000 DNA分子标记物、λHindⅢ标记物、载体PMD18－T购自TaKaRa公司。质粒抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自TIANGEN公司。TRIzol试剂和反转录（RT）聚合酶链反应（PCR，RT－PCR）试剂盒购自Invitrogen公司。其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 RPS27A基因cDNA全长克隆 根据人RPS27A基因cDNA序列（GenBank NM＿002954）以及pGEX4T－1载体上的多克隆位点设计上游引物P1（5′－CGC GGA TCC ATG CAG ATT TTC GTG AA－3′，下划线部分为BamHⅠ酶切位点）及下游引物P2（5′－TCC CCC GGG TTA CTT GTC TTC TGG TTT G－3′，下划线部分为SmaⅠ酶切位点），由上海生工公司合成。收集对数生长期HL－60细胞，TRIzol试剂抽提总RNA，Oligo dT18引物反转录合成RPS27AcDNA第1链；以P1和P2为引物，RT－PCR扩增RPS27A编码区cDNA片段全长，扩增反应条件为95℃5min，94℃45s、52℃1min、72℃1min循环35次，72℃10min，取扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，在紫外分析仪上观察扩增结果并拍照；将胶回收法纯化的目的片段与PMD18－T载体进行T／A克隆重组，挑选单克隆菌落，PCR鉴定阳性克隆送上海生工公司测序；用质粒提取试剂盒抽提经测序验证克隆正确的质粒DNA（TRPS27A）。

1.2.2 pGEX4T－1－RPS27A重组质粒构建 以BamHⅠ和SmaⅠ对T－RPS27A质粒和pGEX4T－1载体进行双酶切，酶切产物用琼脂糖凝胶电泳分离；胶回收法纯化的目的基因DNA片段与线性载体DNA片段在T4连接酶作用下连接过夜，转化感受态JM109细菌；挑取单克隆菌落接种于含氨苄西林（Amp＋）LB培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒DNA，PCR与双酶切法鉴定后将阳性候选克隆送上海生工公司测序。

1.2.3 重组质粒诱导表达 以测序验证正确的pGEX4T1－RPS27A重组质粒转化感受态BL21细菌，挑选单克隆菌落，PCR与双酶切法鉴定；将含重组质粒的BL21细菌接种于Amp＋LB培养基，振荡培养过夜；将过夜培养菌按体积比1∶30接种于新鲜LB培养基，37℃剧烈振荡培养至A600约为0.5，加1mmol／L异丙基－β－D－硫代半乳糖苷（IPTG）培养4h；以冰预冷磷酸盐缓冲液悬浮菌体，超声破碎，离心取上清进行12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE），考马斯亮蓝R250染色后观察结果。

2 结 果

2.1 RPS27A基因cDNA全长克隆 RT－PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，在200bp与500bp之间发现1条清晰DNA条带，大小与目的基因预期片段480bp相符（见图1）。

图1 RPS27AcDNA扩增产物琼脂糖凝胶电泳

2.2 pGEX4T1－RPS27A重组质粒酶切鉴定 PCR鉴定阳性重组质粒双酶切产物琼脂糖凝胶电泳显示，酶切获得的2个片段分别与pGEX4T－1载体（4 950bp）及RPS27A目的片段（480bp）预期大小相符（见图2）。测序结果显示重组质粒中插入DNA片段序列与RPS27A基因cDNA全长完全一致（见图3）。

图2 pGEX4T－1－RPS27A重组质粒酶切鉴定

2.3 GST－UBRPS27a融合蛋白诱导表达 pGEX4T－1－RPS27A重组质粒诱导表达产物电泳图出现了2个过表达蛋白条带，1条与GST－UBRPS27a融合蛋白相对分子质量（RMM）44×103（GST、UBRPS27a的RMM分别为26×103和18×103）相符，表达效率很高，另出现1条RMM稍小的蛋白条带（见图4）。

图3 pGEX4T1－RPS27A重组质粒中插入DNA片段部分测序图谱

图4 SDS－PAGE分析大肠杆菌GST－UBRPS27a重组蛋白的表达

3 讨 论

人UBRPS27a蛋白N端是泛素，C端是RPS27a，两端结构域在不同物种中均高度保守。RPS27a通过C4型锌指结构域与DNA结合，组成核糖体结构，参与蛋白合成。RPS27a通常与泛素融合，主要存在于细胞质中。泛素在核糖体合成过程中作为分子伴侣，在RPS27a进入核糖体之前对其有保护和稳定作用。本研究扩增了RPS27A基因编码区全长cDNA，成功构建了pGEX4T－1－RPS27A重组质粒，并在大肠埃希菌中诱导表达了GST－UBRPS27a融合蛋白，为进一步利用GST标签进行UBRPS27a蛋白纯化、制备其单克隆抗体及研究其结构奠定了基础。蛋白诱导表达产物电泳图显示除GST－UBRPS27a融合蛋白高效表达外，另有1条RMM相对较小的条带（约30×103左右）过表达。为排除其他混杂克隆的干扰，本研究将pGEX4T－1－RPS27A重组克隆在Amp＋LB培养基上进行划线培养，挑取单克隆菌落重新诱导表达后，依然出现该条带。由此可见该蛋白条带是特异的，考虑可能为GST－UBRPS27a融合蛋白部分降解产物，有待后续实验进一步验证。

RPS27A基因的表达在多种肿瘤组织中异常升高，可能在肿瘤发生、发展中具有重要作用。该基因是一种早期生长反应基因，在结肠癌及胃癌组织中的表达明显高于周边正常黏膜组织[4]。而且RPS27A基因在低分化肝癌中的表达较正常水平升高20倍以上，用RNA干扰方法沉默RPS27A基因可导致肿瘤细胞周期停滞及细胞萎缩，说明该基因与肝癌发生有关[6]。RPS27A基因在胰腺癌的癌前病变组织表达水平升高，可用于胰腺癌早期鉴别诊断。深入分析RPS27A基因与肿瘤的关系有利于发现新的肿瘤标志物及临床治疗靶标。但目前对该分子在肿瘤细胞中的具体功能及分子作用机制所知尚少。蛋白激酶CK2与多种肿瘤密切相关，是目前肿瘤治疗研究中的靶点之一[7]。黄功华等[8]采用酵母双杂交技术筛选HL－60细胞cDNA文库时发现，人UBRPS27a是CK2α′亚基的候选结合蛋白。但酵母双杂交系统有可能存在假阳性结果。故本研究诱导表达的GST－UBRPS27a融合蛋白为采用GST pull down试验验证UBRPS27a与CK2α′亚基的相互作用准备了条件，也为后续研究UBRPS27a结构与功能及其在肿瘤发生发展过程的分子调控机制奠定了基础。

[1]Kirschner LS，Stratakis CA.Structure of the human ubiquitin fusion gene Uba80（RPS27a）and one of its pseudogenes[J].Biochem Biophys Res Commun，2000，270（3）：1106－1110.

[2]Ganger DR，Hamilton PD，Klos DJ，et al.Differential expression of metallopanstimulin／S27ribosomal protein in hepatic regeneration and neoplasia[J].Cancer Detect Prev，2001，25（3）：231－236.

[3]Mafune K，Wong JM，Staniunas RJ，et al.Ubiquitin hybrid protein gene expression during human colon cancer progression[J].Arch Surg，1991，126（4）：462－466.

[4]Wong JM，Mafune K，Yow H，et al.Ubiquitin－ribosomal protein S27agene overexpressed in human colorectal carcinoma is an early growth response gene[J].Cancer Res，1993，53（8）：1916－1920.

[5]Revenkova E，Masson J，Koncz C，et al.Involvement of Arabidopsis thaliana ribosomal protein S27in mRNA degradation triggered by genotoxic stress[J].EMBO J，1999，18（2）：490－499.

[6]Fatima G，Mathan G，Kumar V.The HBx protein of hepatitis B virus regulates the expression，intracellular distribution and functions of ribosomal protein S27a[J].J Gen Virol，2012，93（4）：706－715.

[7]Trembley JH，Chen Z，Unger G，et al.Emergence of protein kinase CK2as a key target in cancer therapy[J].Biofactors，2010，36（3）：187－195.

[8]黄功华，梁景耀，陈碧，等.用酵母双杂交系统筛选泛素／核糖体蛋白S27a[J].癌症，2005，24（1）：40－46.