固相萃取-HPLC法测定水样中雌激素残留

李龙飞，金莹，赵晓磊，何金兴，*

（1.齐鲁工业大学食品与生物工程学院，山东济南250353；2.黄岛出入境检验检疫局，山东青岛266555）

雌激素是一类具有相似化学结构，可直接影响动物代谢与繁殖的类固醇激素[1]。己烷雌酚（HEX）、己烯雌酚（DES）和双烯雌酚（DE）是人工合成的雌激素，主要应用于畜牧业生产[2]，对动物的生长催肥具有显著作用。但雌激素可对人和动物的内分泌系统产生强烈干扰，并具有潜在的致癌性[3-5]。鉴于此美国、欧盟等多国已明文规定对其禁用或限用，我国也在2002年明确规定对其禁用[6]。饮水是雌激素进入生物体的重要途径之一，我国水污染现状严重，已有证据表明部分地区日常饮水中存在雌激素[7]，虽然浓度很低，但由于雌激素类物质即使在极低浓度下也会对生物体产生很大的影响[8]，所以为保障饮用水安全，对其进行相应检测十分必要。

目前，测定环境中雌激素残留的检测方法主要有气相色谱法[9]、液相色谱法[10]、免疫酶分析法[11]、毛细管电色谱法[12]、电化学分析法[13]、气相色谱-质谱联用[14]及液相色谱-质谱联用[15]等。然而，上述方法一般需要使用昂贵的仪器设备或进行繁琐的样品衍生化等前处理步骤，才能检测环境中低浓度残留的雌激素，不适于日常样品的检测。与普通吸附材料多为物理吸附不同，本研究以溶胶凝胶技术合成的聚合物为固相萃取材料[16]，利用其具有选择性吸附的特点，结合高效液相色谱进行分析，建立了固相萃取与高效液相色谱联用检测饮用水中3 种雌激素残留的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

岛津LC-20AT 高效液相色谱仪，SPD-M20A 二极管阵列检测器：日本岛津公司；梅特勒AL104 电子天平：中国梅特勒-托利多公司；Supelco 固相萃取装置：美国Supelco 公司；JB-2A 恒温磁力搅拌器：上海雷磁创意仪器仪表有限责任公司。

己烷雌酚、己烯雌酚、双烯雌酚：色谱纯，sigma 公司；乙腈、甲醇：色谱纯，天津化学试剂厂；二次去离子水（DDW，18 MΩ cm-1，Milli-Q 超纯水器制得）；四乙氧基硅烷（分析纯，tetraethoxysilane，TEOS）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（分析纯，3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）、醋酸、磷酸：分析纯，武汉大学化工厂。

标准储备溶液：准确称取DES、DS、HEX 各2 mg，分别置于10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，于4 ℃条件下储存备用。

混合标准储备溶液：准确称取3 种雌激素标准品各5 mg，置于10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容，配置成500 mg/L 的混合标准液，同样于4 ℃条件下储存。工作溶液则按需要用甲醇逐级稀释。

矿泉水：于山东济南长清地区超市购得；自来水：于山东济南长清地区采得。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件的选择

色谱柱Xterra C18（250 mm×4.6 mm，5 μm，Waters，USA），流动相为20 mmol/L H3PO4/甲醇，流速为1.0 mL/min，柱温为38 ℃，进样量为20 μL，检测波长为230 nm。采用色谱峰的保留时间定性，外标法峰面积定量。

1.2.2 标准曲线的绘制

将3 种样品混合标准液分别稀释成质量浓度为10、8、5、2、1、0.5 μg/mL 的标准系列，依次进样分析，然后根据峰面积与质量浓度进行线性回归，绘制标准曲线。

1.2.3 固相萃取柱的制备

在50 mL 具塞的圆底烧瓶中加入5 mL 乙腈，1 mL APTES，磁力搅拌30 min 后加入2 mL TEOS，继续搅拌反应20 min，然后加入1 mL 0.01 mol/L 的醋酸，磁力搅拌10 min，置于水浴锅中60 ℃孵化10 h，过滤，用甲醇洗涤，于真空干燥箱中100 ℃下老化10 h。将所得材料研磨成小颗粒，称取200 mg，作为预富集柱的填料，使用前依次用3 mL 纯水，3 mL 甲醇和3 mL 纯水进行活化处理。

1.2.4 样品制备

试验选用矿泉水和自来水作为样品，经0.45 μm 水系滤膜过滤，于4 ℃条件下保存。使用时先用0.1 mol/L的盐酸溶液或氢氧化钠溶液调整pH，然后经固相萃取柱富集，富集体积100 mL，用适当的洗脱液洗脱，将洗脱液用氮气吹干，并用1 mL 甲醇溶解，经0.45 μm 有机系滤膜过滤，注入HPLC 检测分析。

制备加标样品。取适量的混合标准储备液，加入矿泉水与自来水样品中，分别配制成质量浓度为50、100、150 μg/L 的混合标准样品工作液，检测过程与上述样品相同。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

以20 mmol/L H3PO4/甲醇作为流动相，研究不同比例对3 种雌激素分离效果的影响。

图1 3 种雌激素混合色谱图Fig.1 Chromatograph of estrogen mixed standard solution

从图1 可以看出，20 mmol/L H3PO4/甲醇比例为36 ∶64（体积比）时，3 种雌激素在17 min 内可以达到完全的基线分离，且各色谱峰具有良好的对称性。根据单标色谱图的结果可知图1 中依次出现的3 种雌激素分别是DES、DS、HEX。

2.2 固相萃取条件的选择

将200 mg 合成聚合物装填在预富集柱中，富集水溶液中的雌激素残留，为达到最佳的萃取效果，分别对洗脱溶剂、样品溶液pH、富集流速和洗脱流速等条件进行优化。

2.2.1 洗脱溶剂的选择

选择浓度为100 μg/L 的混合样品溶液进行上样，富集体积为100 mL，富集流速为1 mL/min，洗脱流速为1 mL/min，然后分别用3 mL 甲醇、乙腈进行洗脱，按1.2.4 方法处理后进行HPLC 分析，记录出峰面积。不同的洗脱溶剂对三种雌激素的洗脱效果如图2 所示。

图2 不同洗脱剂对3 种雌激素洗脱效果图Fig.2 Effect of different elution on extraction efficiency

从图2 中可以看出当以甲醇、乙腈作为洗脱剂时，乙腈对三种雌激素的洗脱效果除己烷雌酚外，其余两种雌激素的峰面积均较低，同时可以看出甲醇的洗脱效果整体明显优于乙腈，所以最终选择甲醇作为洗脱剂。

2.2.2 pH 对萃取效果的影响

分别配制浓度为100 μg/L，pH 为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 的雌激素水溶液100 mL，控制流速为1 mL/min进行富集，然后用3 mL 甲醇洗脱，洗脱流速为1 mL/min，按1.2.4 方法处理后进行HPLC 分析，记录出峰面积，结果见图3。

图3 不同pH 对雌激素富集效果的影响曲线Fig.3 Effect of pH on extraction efficiency

由图3 可见，pH 在4.0～8.0 范围内，3 种雌激素的峰面积变化不大。DS，HEX 在pH 低于6.0 时，峰面积均随pH 的增加而增大，当pH 超过6.0 时，峰面积略有下降；而DES 在pH 超过7.0 时开始下降，但鉴于DES 在pH 6.0 与pH7.0 时的峰面积相差不大，最终选择基质pH 为6.0 用于后续的试验。

2.2.3 富集流速对萃取效果的影响

用100 μg/L 的雌激素水溶液上样100 mL，以考察富集流速对3 种雌激素吸附效果的影响。从图4 可以看出，富集流速在0.5 mL/min 到2.0 mL/min 范围内，3种雌激素的色谱峰面积一直呈下降趋势，但过慢的富集流速势必会影响到整个富集分析过程的效率，综合考虑，最终选择1 mL/min 作为适当的富集流速。

图4 富集流速对雌激素富集效果的影响曲线Fig.4 Effect of enrichment flow rate on extraction efficiency

2.2.4 洗脱流速对萃取效果的影响

与富集流速相同，洗脱流速也是影响分析效率的重要参数，以1.0 mL/min 的流速上样吸附后用甲醇洗脱，洗脱流速分别控制为0.5、1.0、1.5、2.0 mL/min，测定结果如图5 所示。

图5 洗脱流速对雌激素分离效果的影响曲线Fig.5 Effect of elution flow rate on the desorption of estrogen

可以看出，洗脱流速在0.5 mL/min 和1.0 mL/min时对3 种雌激素的解吸效果相差不大，进一步提高洗脱流速则解吸效果开始明显下降，可能的原因是过快的洗脱流速致使洗脱液无法与被萃取物充分作用，考虑到纯化效率，洗脱流速最终选定为1.0 mL/min。

2.3 标准曲线、线性范围和检测限

以雌激素质量浓度X（μg/mL）与相应的目标组分的峰面积Y（S）做标准曲线，3 种雌激素对应的线性方程及相关系数如表1 所示。

表1 3 种雌激素的标准曲线回归方程与相关系数（R2）Table 1 Standard curve and relevant coefficient of three estrogens

从表1 中可以看出，各标准曲线相关系数R2均大于0.99，说明3 种雌激素的线性关系良好。

逐步选择较低及较高浓度的混合标准储备液进样分析，测得峰面积，通过标准曲线求出线性范围。由此测得DES 的线性范围是0.05 mg/L～500 mg/L，DS 的线性范围是0.05 mg/L～500 mg/L，HEX 的线性范围是0.1 mg/L～500 mg/L；根据3 倍噪音的峰面积响应值求出最低检出限（LOD），其DES、DS、HEX 的最低检出限分别为0.10，0.18 和0.29 μg/L。

2.4 加标回收率及重复性

用矿泉水与自来水分别配制3 个浓度水平的雌激素混合标准工作液，其中每个浓度水平重复测定5次，测定结果的相对标准偏差为3.5%～7.8%（n=5），其结果见表2，表3。

表2 矿泉水中雌激素加标的重复性测定情况Table 2 The extraction peak areas and RSD of estrogen in mineral sample

表3 自来水中雌激素加标的重复性测定Table 3 The extraction peak areas and RSD of estrogen in tapwater sample

由此可知，该方法具有较好的重现性。经HPLC分析，根据回归方程计算样品加标回收率（见表4）。

由表4 可以看出，3 种雌激素的加标回收率为70.4%～80.1%，可满足水样中雌激素残留的痕量检测需要。相对标准偏差计算公式如下：

表4 不同样品添加浓度对应雌激素的回收率Table 4 The recoveries of estrogen on three different spiked concentrations

2.5 实际样品的测定

在优化的条件下，对市售矿泉水及自来水样品进行检测，其中己烯雌酚、己烷雌酚和双烯雌酚均未检出。样品色谱及其加标色谱如图6、图7 所示。

图6 矿泉水样品色谱图Fig.6 Chromatograph of a blank mineral sample and mineral sample spiked with 50 μg/L

图7 自来水样品色谱图Fig.7 Chromatograph of a blank tap-water sample and tap-water sample spiked with 50 μg/L

3 结论

普通固相萃取材料的吸附性质多为物理吸附，虽具有一定的富集与净化效果，但相对选择性较差。本研究以溶胶凝胶技术合成的聚合物为固相萃取填充材料，其功能单体与雌激素间被认为可通过氢键相互作用，从而以非共价键连接，具有选择性吸附的特点。该法前处理操作简便快捷，结合高效液相色谱，建立了同时测定日常饮水中3 种雌激素残留的检测方法。在优化的条件下，3 种雌激素的最低检测限为0.1 μg/L～0.29 μg/L，加标回收率为70.4 %～80.1 %，且RSD 为3.5%～7.8%，可满足定量分析的需要，方法简便、灵敏、准确，适用于该类激素的残留监控。

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