糖水水果罐头中主要腐败微生物的分离纯化及鉴定研究

许美玲，张鑫，杨娟，陈伟，杜震，董丽君，张丽，周洪娟，郝建光

（临沂出入境检验检疫局，山东临沂276034）

罐头是我国具有传统特色的产业，是我国主要的加工食品，在出口食品中占有重要地位。其中，水果罐头是国内外罐头食品市场颇受欢迎的产品，约占罐头总产量的25%，具有较大的发展前景[1-2]。糖水水果罐头虽然经过杀菌处理，但有时在罐头食品中仍然可能有微生物存在，导致水果罐头中果肉发生腐败变质。对由于不同罐头制品营养环境各不相同，其污染菌也不尽相同，在实际检测中常常采取不同性质的培养基利于检出特定的污染菌[3]。为防止水果罐头腐败变质，延长货架期，保护我国消费者健康安全及出口食品安全，本文旨在对糖水水果罐头中的污染微生物进行分析，探索糖水水果罐头中微生物检测方法，降低微生物污染率。同时，也为罐头食品微生物检测提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 样品来源

草莓罐头、黄桃罐头：来源于工厂发生腐败变质的罐头，罐内果肉组织解体。

1.1.2 培养基

1）硫乙醇酸盐液体培养基（FT）、锰盐营养琼脂、酸性肉汤、溴甲酚紫葡萄糖肉汤、疱肉培养基基础、麦芽浸膏汤均购自北京陆桥技术有限责任公司。

2）嗜热耐酸芽孢杆菌培养基：酵母浸膏5 g，蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，磷酸氢二钾4 g，琼脂粉18 g，水1 000 mL，121 ℃，15 min 高压灭菌。

3）AC 琼脂：酵母浸膏3g，蛋白胨20g，牛肉膏3g，麦芽浸膏3 g，葡萄糖5 g，VC0.2 g，琼脂粉18 g，水1 000 mL，121 ℃，15 min 高压灭菌。

4）硫乙醇钠琼脂培养基：按每100 mL 硫乙醇胺肉汤加入1.5%～2.0%琼脂粉，121℃，15 min 高压灭菌。

1.1.3 试剂

细菌琼脂粉、葡萄糖、胰酪蛋白胨、麦芽浸粉、牛肉浸粉、酵母浸膏、牛肉膏、蛋白胨均购自北京陆桥生物技术有限公司；磷酸氢二钾、氯化锰均为分析纯；BD生化鉴定板条购自美国BD 生物技术有限公司。

1.1.4 仪器

MOS-3020 SNAYO 高压灭菌锅、MIR-253 生化培养箱：日本三洋电子有限公司；BUG BOX M 厌氧微生物培养工作站：英国RUSKINN 公司；CLASSⅡTYPE A2 生物安全柜：北京东联哈尔仪器制造有限公司；PHOENIX 100 微生物鉴定仪：美国BD 设备有限公司；BX41 OLYMPUS 生物显微镜：日本奥林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 培养方式

采用35、55 ℃两种温度；有氧与厌氧环境。

1.2.2 密封性检验

将罐头制品放入水中，观察有无气泡产生[4]。

1.2.3 内容物增菌

将待测样品放置在超净工作台上，开启紫外灯30 min后，用75%酒精进行表面消毒。用灭菌开罐器开启罐顶，如系胖听罐头可用注射器吸取少许罐头内气体用以鉴定气体种类。无菌取出罐头样品至均质袋内均质，分别取1 mL 内容物转入疱肉肉汤、溴甲酚紫葡萄糖肉汤、麦芽浸膏肉汤、硫乙醇酸钠肉汤、酸性肉汤增菌培养基中，分别在35、55 ℃两种温度下连续培养96 h，每24 小时观察记录一次。

1.2.4 分离培养

分别选用疱肉琼脂培养基、溴甲酚紫葡萄糖琼脂培养基、硫乙醇酸钠琼脂培养基、嗜热耐酸芽孢杆菌培养基、AC 琼脂培养基、麦芽浸膏琼脂培养基进行分离培养。连续培养120 h，每24 小时观察记录试验现象。

1.2.5 纯培养

将各培养基中培养物挑取单菌落分别接种到与其相对应的培养基中，进行纯培养。

1.2.6 厌氧培养和高温验证试验

将有氧分离的纯培养物接种到疱肉琼脂培养基、溴甲酚紫葡萄糖琼脂培养基、硫乙醇酸钠琼脂培养基、嗜热耐酸芽孢杆菌培养基、AC 琼脂培养基、麦芽浸膏琼脂培养基，分别置于厌氧微生物工作站中，在35、55 ℃以及有氧环境55 ℃条件下培养。55 ℃条件下培养的培养基在培养96 h 后放入35 ℃条件下继续培养48 h，观察并记录实验现象。

1.2.7 鉴定方法

采取革兰氏染色、芽孢染色[5]等染色方法相结合的方式对试验中的微生物进行鉴定，根据其生长特征、生理特征、外观形态并结合细菌鉴定手册[6]、伯杰细菌鉴定手册[7]进行进一步判断，最后利用微生物鉴定仪进行菌种综合鉴定。

2 结果与讨论

2.1 罐头密封性检测结果

实验所用罐头密封性良好，放入水中并未产生气泡。草莓罐头内容物的pH 经测定为2.88，黄桃罐头内容物的pH 为3.46，同批次正常草莓罐头和黄桃罐头的pH 范围分别为3.4～3.6 和3.6～4.0，草莓罐头发生了酸化，pH 降低，而黄桃罐头pH 在正常范围内。因pH小于4.6，属于酸性罐头。本次实验所选用的两种糖水水果罐头均未发现胖听现象。

2.2 罐头中腐败微生物增菌结果及分析

不同增菌液的增菌效果见表1。

表1 黄桃罐头、草莓罐头中腐败微生物增菌实验结果Table 1 Choice of optical medium for enriching spoilage bacteria isolated from canned peach and canned strawberry in various media respectively

由表1 可以看出，在培养24h 内未发现菌落生长现象，培养48 h 后培养基出现不同程度的浑浊现象，溴甲酚紫葡萄糖肉汤紫色褪去，疱肉肉汤中出现产酸产气现象。黄桃罐头在35 ℃条件下，在硫乙醇酸钠肉汤中培养效果最好，在溴甲酚紫葡萄糖肉汤中未见生长，在55 ℃培养条件下，未见生长。草莓罐头在35 ℃条件下，在酸性肉汤、麦芽浸膏肉汤中培养效果最好，在55 ℃条件下，在溴甲酚紫葡萄糖肉汤、麦芽浸膏肉汤中培养效果最好，在两种温度下，酸性肉汤中未见生长。

2.3 罐头中腐败微生物分离、纯化与培养

2.3.1 罐头中腐败微生物分离培养结果与分析

腐败微生物分培养结果见表2。

在进行分离培养时，黄桃罐头在疱肉琼脂培养基、溴甲酚紫葡萄糖琼脂培养基和硫乙醇酸钠琼脂培养基上培养效果最好，草莓罐头在疱肉琼脂培养基、AC 琼脂培养基和嗜热耐酸芽孢杆菌培养基上分离培养效果最好。所有培养基在24 h 内均为发现菌落生长，培养48 h 后培养效果渐佳。

2.3.2 罐头中腐败微生物纯培养结果与分析

罐头中腐败微生物纯培养结果见表3。

表2 罐头中腐败微生物培养基分离筛选结果Table 2 Growth status of spoilage bacteria isolated from canned peach and canned strawberry in various media respectively

表3 罐头中腐败微生物纯培养结果Table 3 Growth status of pure culture of spoilage bacteria isolated from canned peach and canned strawberry in various media respectively

在疱肉琼脂培养基、溴甲酚紫葡萄糖琼脂培养基、硫乙醇酸钠琼脂培养基上，分离得到的单菌落生长状况最佳，在24 h 时即可达到较好的生长状态。而其他几种培养基也有生长，但生长缓慢。由此可以看出，疱肉琼脂培养基、溴甲酚紫葡萄糖琼脂培养基、硫乙醇酸钠琼脂培养基是较好的纯化培养基，其他培养基生长效果较差。

2.3.3 罐头中腐败微生物厌氧培养结果与分析

通过对纯化的4 株菌株进行厌氧培养，48 h 时观察结果发现，A 菌株在厌氧条件下不生长，B、C、D 菌株在厌氧条件下生长良好。

2.4 罐头中腐败微生物的鉴定

2.4.1 菌落形态特征和镜检结果

分离的腐败微生物菌落形态及革兰氏染色镜检结果见表4。

2.4.2 微生物鉴定仪鉴定结果

根据对分离纯化菌株革兰氏染色结果，选择BD细菌的快速鉴定板条，系统给出的鉴定结果见表5。

表4 罐头中污染菌形态观察Table 4 Cell morphology of bacterium in canned peach and canned strawberry

表5 分离到的微生物鉴定结果Table 5 The identification results of the isolated micro-organism

3 结论

1）罐头食品中的微生物受食品中的pH 的影响

罐头食品按pH 的不同可分为低酸性食品和酸性食品，pH≥4.6 为低酸性食品，pH≤4.6 为酸性食品。糖水水果罐头pH 在2.5～3.5 之间，故糖水水果罐头为酸性食品。酸性罐头食品能生长繁殖的耐酸的微生物无论在数量上还是在种类上都远比低酸性罐头食品少。微生物生长环境不同，分离得到的污染菌也不尽相同。因此，选择合适的增菌肉汤及分离培养基尤其重要。通过糖水水果罐头在不同增菌培养基及分离培养基分离结果，可以看出：黄桃罐头硫乙醇酸钠肉汤中增菌效果最好，在疱肉琼脂培养基、溴甲酚紫葡萄糖琼脂培养基和硫乙醇酸钠琼脂培养基上培养效果最好，这与史振霞等的研究结果类似[8]；草莓罐头在酸性肉汤、麦芽浸膏肉汤中增菌效果最佳，在疱肉琼脂培养基、AC 琼脂培养基和嗜热耐酸芽孢杆菌培养基上分离培养效果最好。

2）通过生化实验，结合细菌鉴定手册、伯杰细菌鉴定手册和BD 微生物鉴定仪，发现黄桃罐头、草莓罐头腐败过程中滋生的主要微生物为：A 菌为成团泛菌（Pan.agglomerans）；B 和C 菌株为同一种菌，为地衣芽孢杆菌（Baci. licheniformis）；D 菌为蜡样芽孢杆菌（Baci.cereus）。

[1] 任国平,张倩,范丽平,等.水果罐头加工中生物危害的分析和控制[J].食品研究与开发,2011,32(9):210-212

[2] 杜红利,刘畅.罐头制品中微生物检测方法[J].肉类工业,2008,11:40-42

[3] 闫训友,杜洪利,张艳丽,等.山楂罐头中腐败微生物的分离鉴定及其特性的研究[J].食品工业科技,2010,31(5):191-194

[4] 马长利,张志新,郝子成.热解糖梭菌致蘑菇罐头膨胀变质的实验分析[J].中国食品卫生杂志,2005(5):433-435

[5] 罗雪云,刘宏道.食品卫生微生物检测标准手册[M].北京:中国标准出版社,1995:400-438

[6] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001

[7] R E 布坎南,N E 吉本斯.伯杰细菌鉴定手册[M].8 版.北京:科学出版社,1984

[8] 史振霞,杜洪利,欧旭,等.桃罐头中腐败微生物的分离纯化及鉴定研究[J].食品科学,2009,30(21):278-282