G蛋白偶联受体激酶功能紊乱与阿尔兹海默病的相关性

柏慧，严光

(安徽医科大学附属省立医院、安徽省立医院老年医学科，合肥230001)

阿尔兹海默病(AD)是一种中枢神经系统退行性疾病，临床以记忆和其他认知功能的渐进性丧失为主要特征，病理上主要表现为相关皮质下的老年斑积聚(SPs)和神经元纤维缠结(NFTs)［1-2］。AD严重影响人们身心健康，可导致持续性进行性痴呆，但目前还无有效治疗措施。其患者总数逐年增加，预计到2020年将超过现在的2倍，这个特殊病人群体的治疗费用也因为治疗措施的昂贵而不成比例的增加。因此，充分理解AD发病机制对提高预防治疗水平是非常迫切的。人们已对AD的各种发病机制展开了深入的研究，本综述将对阿尔兹海默病中G蛋白偶联受体激酶(GRKs)功能紊乱的研究进展做一简要总结。

1 GRKs

1.1 GRKs家族 GRKs首次发现于受体脱敏过程中，属丝氨酸/苏氨酸激酶家族。依据序列同源性可将GRKs分为三组:视紫红质激酶亚家族(GRK1和GRK7)，β肾上腺素受体激酶亚家族(GRK2和GRK3)，GRK4亚家族(GRK4、GRK5 和 GRK6)。这些激酶既有共性也有特性，GRK2、3、5和6广泛存在于哺乳动物的组织中，而GRK1、4和7只存在于个别器官中。其中GRK1和7表达于视网膜杆状和锥状细胞，GRK4存在于睾丸、小脑和肾脏［3］。

1.2 GRKs的功能 GRKs在结构上包含一个中心位于第263-266的氨基酸催化区，侧面是大的氨基和羧基末端调节区。GRKs的氨基末端调节区的共同区域论证了结构的同源性。这些结果暗示了氨基末端调节区可能会执行所有GRKs的一个共同功能，这个功能很可能是受体识别。GRKs的主要功能是使活化的G蛋白偶联受体(GRCPs)脱敏化，这个负性调节过程包括磷酸化活化的受体，解偶联G蛋白受体，启动受体内在化。GRKs磷酸化激活状态下的 GPCRs，受体磷酸化后与抑制蛋白(arrestins)结合，致受体与G蛋白脱偶联，引起受体脱敏。受体与arrestins结合后，参与网格蛋白介导的细胞内吞作用，依据传统观点这种内吞作用再次激活受体，并将其运回质膜重新利用［4-5］。因此，位于G蛋白-受体界面的GRKs的主要功能就是使激活状态的GRCPs发生脱敏。

1.3 GRKs的共性和特性 GRKs的体外研究认为GRKs的共性可能就是GRKs的七种亚型可以磷酸化不同的GRCPs可能不存在差异性［4］。随着GRK的转基因和基因敲除小鼠的产生，体内试验明确证实了 GRKs的功能特性。例如，缺乏 GRK2，3，5，6的老鼠分别展现出对肾上腺素、毒蕈碱、多巴胺受体脱敏的选择性损伤［6-9］。隐藏在体内这种功能特异性之下的分子机制仍有待阐明。

1.4 GRKs的亚细胞分布 体外实验已证实GRK2和GRK5可以磷酸化突触核蛋白［10］。另有研究报道GRK的独立功能，如GRK5可以抑制核因子NF-κB的活动［11-12］。尽管如此细胞膜上的GRCP仍然是GRKs的主要底物，这一特性决定了GRKs在细胞膜上执行主要功能。GRK4亚家族成员主要位于静息细胞的质膜上，与磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)、磷酸丝氨酸(PS)结合，可以磷酸化被激动剂激活的GRCPs［4］。其他 GRK 亚科主要位于细胞质中，当GRCPs被激活后，才易位到胞膜上执行功能。因此，凡是可以改变这些调节因子细胞浓度的因素可能会改变GRKs的亚细胞位置及活性。

2 GRKs功能紊乱和AD的联系

细胞水平的健康依赖于细胞信号传导系统的动态平衡。AD的病理学特征之一是神经信号传导系统失衡。主要表现为:(1)某些蛋白激酶的活动增强以及某些蛋白磷酸酶酯的活动减弱导致神经纤维变性［13］;(2)β-淀粉样蛋白(Aβ)的水解增加以及清除减少导致大脑淀粉样变［14］;(3)神经小胶质细胞和星形胶质细胞的过度激活导致神经元炎症性损伤［15］。已有研究发现AD的信号传导系统以过度活跃为特征［16］，尤其归因于众多GPCRs及其下游信号［17］。更具体的说，一些研究者指出信号传导缺失的部位在GRKs主要活动的受体-G蛋白界面［18］。

2004年，Suo等［19］最早就 GRKs功能紊乱与AD关系做了研究。他们调查了低剂量可溶性Aβ预处理的细胞如小胶质细胞、神经元等对一些GRCP刺激物如凝血酶等非常敏感的原因。结果发现做过Aβ预处理后，胞膜上的GRK5迅速转移至胞质，而胞质里的GRK2没有被转移至胞膜，使得GRK的活性受抑制，凝血酶信号通路中的GRCP受体不能及时脱敏，最终导致预处理后的细胞极度活跃。目前对Aβ改变GRK亚细胞位置的机制还不是很清楚。但不难想象的是，Aβ对细胞内钙离子浓度和胞膜磷脂的影响在其中起到了非常重要的作用。他们在体外实验中同样发现TgCRND8转基因小鼠胞膜上GRK2和GRK5含量减少，而胞质中GRK2和GRK5含量增加。所有这些改变从AD前驱期开始一直持续到晚期阶段。之后在AD患者尸体的大脑中证实了GRK亚细胞位置的晚期改变［20］。

2.1 GRK2功能紊乱与AD 早期已有实验详细描述了AD转基因小鼠大脑中GRK2的变化［19］。它包括两方面:胞膜上GRK2浓度的中度下降和胞质中GRK2浓度的显著提高。之后的研究又证实了AD患者大脑样本中GRK2过度表达，且沉积在损伤的线粒体和NFTs［21-22］。有趣的是，AD患者外周血样本中的GRK2总体水平不仅高于对照组，且与认知水平负相关［23］。在 GRK2缺失小鼠模型中，GRK2缺失后通过影响β肾上腺素受体脱敏，造成不可补偿的缺陷，而这一结果仅限于心血管系统［6］。也就是说，由AD患者胞膜上GRK2浓度的适度下降引起的一些病理改变可能仅限于心血管系统。由于GRK2在组织中广泛存在和表达，对由GRK2总浓度升高产生的潜在影响，可能不只在脑血管方面，还包括线粒体损伤和NFTs。但事实上，在GRK2转基因小鼠中GRK2只在心血管系统中过度表达［24］，这也为确认GRK2在心血管系统中的作用提供了依据。

这些体内体外研究结果提示GRK2的过度表达是一个早期事件，发生在AD的前驱阶段，这一阶段的损伤是可逆的。到目前为止，相关研究还停留在GRK2功能紊乱和AD关联性的研究上。AD患者同时存在神经损伤和血管并发症，这一发病机制是否与GRK2功能紊乱有关?对此的认识还限于对心脑关联的理解上［25］。

2.2 GRK5功能紊乱与AD AD转基因小鼠的GRK5变化同样包括胞膜上GRK5浓度的下降和胞质中 GRK5浓度的上升，但总体水平改变不明显［19］。同GRK2转基因小鼠相似，GRK5转基因小鼠的基因也加有心脏特殊启动子，不适合用于研究非心血管组织中GRK5过度表达的影响。然而，体外研究的最新成果报道GRK5的RH区通过激酶依赖的机制抑制了核因子NF-κB，导致了肿瘤细胞的凋亡［11-12］。如果这种影响在体内实验也存在，那么胞浆中GRK5浓度的提高同样可以促使神经细胞的退化。

2.2.1 胞膜上GRK5的缺失在AD发病机制中的作用 为了执行在GRCP脱敏中的主要功能，GRKs要么如GRK5预先位于胞膜上，要么添补到胞膜上。特别在发现GRK5某些与激酶无关的功能之前，使GRCP脱敏被认为是GRK5的全部功能。GRK5缺失特指GRK5在胞膜上和功能上的缺失，而不是全体GRK5的下调。

2.2.2 导致GRK5缺失的因素 GRK5的亚细胞位置由促胞膜结合因素和促胞质结合因素之间的平衡来调节。与AD或衰老相关的因素打破这一调节平衡导致胞膜GRK5缺乏。低剂量的可溶性Aβ就是其中因素之一［19］，它与 AD关系密切。除此之外，谷氨酸、高同型半胱氨酸以及氧化应激都可以引起胞膜GRK5缺失。事实上虽然总体GRK5随着年龄的增长是上调的，但与年轻小鼠相比，衰老小鼠的胞膜GRK5仍显著缺乏。通过这些初步观察结果可以推测:胞膜GRK5缺乏可能与正常衰老中的基因变异有关，而在AD中GRK5缺失则更为严重。

2.2.3 GRK5缺乏在病理上的影响 关于这方面的证据主要是从GRK5缺乏的小鼠模型如GRK5KO小鼠和GRK5KO/APPsw小鼠中得到的。可以预料的是，GRK5KO小鼠可以产生一种编码第1-178氨基酸的转录物，这种转录物覆盖了RH区的第50-176氨基酸［8］。这就意味着GRK5KO小鼠只是在GRK5中缺乏依赖激酶活性的功能形式，依赖于GRK5的RH区或不依赖于激酶的区域却没有改变。另外，与其他AD小鼠模型相比，基因修改还没有发生在与AD相关的基因如β-淀粉状蛋白前体蛋白(βAPP)、早老蛋白、tau蛋白、载脂蛋白E等。因此，这些小鼠的表型仅仅由GRK5活性的丧失或缺乏导致的。

给予非选择性毒蕈碱激动剂的年轻大鼠展现出轻度自发性低体温和显著的行为超敏［8］，老年对照组则展示了明显的短时程工作记忆短缺和低敏感性［26］。遗忘型轻度认知障碍或多或少参与病理改变水平的调节，这种病理改变包括轴突缺陷，突触蛋白及毒蕈碱受体下降，海马可溶性Aβ和tau蛋白水平上升。突触素水平是突触退化的权威性标志物，但在雌雄混合老鼠中并未显著改变，但之后只在GRK5KO雌鼠中发现突触素水平明显下降［27］。除了在电子显微镜中观察到的微量类似Aβ的纤维状结构和被活性星形胶质包裹的退化轴突成分，没有发现任何SPs或炎性反应的改变。分级辨别函数分析得出不同基因型组别之间的区别很明显，这支持了GRK5存在显著的基因剂量效应。因此，单独GRK5缺乏可以导致遗忘型轻度认知障碍的发生，加速了衰老过程中与AD相关的病理进程。

GRK5缺乏最初被发现选择性损伤毒蕈碱受体脱敏［8］，近期有研究证实了这一发现并一步论述了这种选择性主要针对毒蕈碱受体中全部M2、部分M4，但不包括 M1［28］。众所周知，M1、M2、M4 在海马中含量丰富。M2/M4作为主要的突触前受体，负性调节着海马记忆回路中乙酰胆碱的释放［29］。GRK5缺乏在病理方面的潜在影响可能是双重的:(1)它直接引起突触前M2/M4自身受体信号的延长或者突触前胆碱能过度活跃;(2)突出前胆碱能过度活跃反过来导致海马记忆回路中ACh释放减少，使得包括突触后M1在内的突触后胆碱能活动减退。对于这一点，已有研究证实了GRK5缺乏导致了 ACh 释放减少［28］。

对GRK5缺陷的APPsw老年小鼠的最初研究发现:相对于APPsw小鼠，GRK5KO缺陷的APPsw小鼠的大脑发生了非常严重的炎性反应，包括微球蛋白和星形胶质蛋白的形成［30］。GRK5KO小鼠大脑中未发现任何炎症性反应，但与APPsw小鼠杂交后，却表现出比 APPsw小鼠更为严重的炎症性反应。这种严重的炎症性反应是GRK5缺陷和APPsw过度表达协同作用的结果。另外有研究还发现在GRK5KO老鼠中可溶性 Aβ浓度有了中度的增长［26］。GRK5缺失可能会促进GRK5缺陷的APPsw小鼠的Aβ积聚，最终导致更严重的炎症性反应。

2.2.4 GRK5缺乏和现存AD发病机制假说的关系

关于AD的致病因素和发病过程的讨论由来已久，在众多假设当中，胆碱能损伤假说和Aβ毒性假说是其中广为接受的两种，它们极大促进了AD药物学研究的发展［31］。前者认为，中枢胆碱能神经功能障碍在很大程度上是AD认知功能下降的主要原因;后者则提出AD的中枢致病分子是Aβ。随着对AD发病机制的逐渐深入了解，关于假说细节的描述得到不断完善，这使得这些假说的地位更加牢固［31-34］。关于GRK5缺失的研究可能会成为两种假说联系的桥梁。一方面，Aβ是GRK5缺乏的主要诱导因素之一;另一方面，GRK5的缺乏选择性地使胆碱能功能受到损伤。已有研究［35-36］显示胆碱能异常，特别是突触后胆碱能活动减退，通过β淀粉生成途径影响APP过程，最终促进了Aβ生成。这些过程形成一个恶性循环，导致Aβ的积聚和胆碱能异常，加速了AD的病理进程。

3 结论与展望

GRKs功能紊乱不仅与AD大部分病理过程具有紧密的相关性，并且是导致Aβ积聚与胆碱能功能障碍之间恶性循环的主因之一。展望GRKs理论的未来，由于上述原因的存在，使得其具备成为一个理想的AD等神经退行性疾病的有效预防和治疗靶点的强大可能性。

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