EB病毒相关胃癌的研究进展

宋飞雪，裴霞霞

EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)是一种常见的具有致瘤性的人类疱疹病毒，全世界超过90%的成人都感染过EBV。EBV基因组大致包括末端重复序列(LTR)、4个内部重复序列以及被内部重复序列隔开的若干个单一序列区。只有少数几个基因能在被EBV感染后形成的永生化淋巴母细胞系中表达，这几个基因可以表达6种核抗原(EBNA1～EBNA6)、3种潜伏膜蛋白(LMP1、LMP2、LMP3)和2种小核糖核酸(EBER1、EBER2)[1]。

EBV具有较强的细胞转化作用，与很多肿瘤的发生、发展有密切的联系，如Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌等。1990年，Burke首次报道用聚合酶链反应(PCR)技术在未分化淋巴上皮瘤样胃癌组织中检出EBV DNA[2]，之后越来越多的研究证明EBV与胃癌相关。EBV相关胃癌(EBV associated gastric carcinoma，EBVaGC)占胃癌的10%左右[3]，各地区此比例不同。

1 EBVaGC的流行病学和临床特征

EBER原位杂交(ISH)被用于确定EBVaGC，因为在每个受感染的细胞中EBER都高度表达(107拷贝/细胞)，胃癌细胞中EBER表达阳性者即定义为EBVaGC。典型的肿瘤细胞核EBER1-ISH表达呈阳性，四周被淋巴间质环绕。EBVaGC标本中，几乎所有的癌细胞中EBER表达呈阳性，而癌旁正常组织无EBER表达，提示胃癌形成的早期即发生了EBV感染，感染EBV的肿瘤细胞单克隆增生，从而使EBVaGC组织中几乎所有的癌细胞表达EBER[4]。

1.1 流行病学 大多数研究显示EBVaGC与年龄无明显相关性，但EBVaGC发病在男性中占优势，表明男性可能存在生活方式或职业因素方面的发病风险。日本的一项研究表明，频繁摄入咸的食物和暴露于木粉和/或铁屑可引起胃上皮细胞机械性损伤，与EBVaGC高发病风险相关[5]。与Burkitt淋巴瘤和鼻咽癌不同，EBVaGC是一种非地方性疾病，其广泛分布在世界各地，但发病率因地区而异，美洲大陆国家如智利和美国EBVaGC发病率明显高于亚洲国家[6]。

1.2 临床特征 EBVaGC具有明显的临床病理学特征，主要表现在男性发病率高并呈弥漫性分布[7]。以往研究均显示EBVaGC在男性中的发病率较高，尚未有研究显示其在女性中占优势。在其他消化道器官(结肠和食管)中未检测到EBV编码的小RNA表达[8]，表明在消化道器官中，胃的上皮细胞和环境的改变对EBV相关肿瘤形成具有重要意义。在EBVaGC组织中可检测到EBV DNA及大量经其编码的小RNA和EBER。EBVaGC可发生于任何类型胃腺癌，但中分化型和低分化型胃腺癌中EBVaGC的发病比其他类型的胃腺癌多见[3]。

依据组织学分型，EBVaGC可分为淋巴上皮瘤样胃癌和普通型胃癌，二者比例约为1∶4。超过80%的淋巴上皮瘤样胃癌与EBV感染相关[9]，典型的组织学表现为低分化癌并丰富的淋巴细胞浸润。而普通型胃癌中，一般是中、低分化型腺癌较易感染EBV[10]。这两种组织学类型的EBVaGC均好发于胃的近端。

部分EBVaGC在肿瘤局限于黏膜层时呈现出“花边样”改变：小腺管或索状结构呈不规则分枝及愈合增生形态。当肿瘤侵及黏膜下层时常伴有大量淋巴细胞浸润，多为CD8+的细胞毒性T淋巴细胞[11]，表明在EBVaGC中保留了肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞活性。除了CD8+T细胞浸润，自然杀伤细胞、树突细胞和Ki67阳性细胞的平均值和等级在EBVaGC中明显高于EBV阴性胃癌(EBV negative gastric carcinoma，EBVnGC)[12]。

2 EBVaGC的发病机制

EBVaGC的发病机制目前并不十分清楚，近年来国内外学者对EBVaGC做了一系列研究，提出了多种相关学说，但尚未得到充分证据证实。

2.1 EBV感染上皮细胞和B淋巴细胞的机制

2.1.1 CD21依赖性EBV感染途径 EBV通过不同的机制感染人类B淋巴细胞和上皮细胞。EBV通过外包膜糖蛋白gp350/220和B淋巴细胞表面丰富的CD21分子或人类补体受体2型(CR2)高亲和性结合[13]，通过受体介导的细胞内吞噬作用进入B淋巴细胞后，病毒的外膜与细胞质小泡发生融合，将病毒衣壳释放到细胞质内。

2.1.2 CD21非依赖性EBV感染途径

2.1.2.1 EBV的gp350与其特异性的多聚体IgA结合 EBV的gp350与其特异性的多聚体IgA有效地结合，介导EBV对胃上皮细胞的黏附和感染。多聚体IgA通常存在于人类唾液中，可与上皮细胞表面受体分泌成分(SC)结合，而SC是一个在极化上皮细胞基底侧表达的跨膜蛋白。因此，EBV与其特异性多聚体IgA结合，再通过IgA与SC结合形成EBV/IgA/SC复合体，从而感染上皮细胞。

2.1.2.2 gH和gL在EBV感染上皮细胞中的作用 在缺乏CD21时，EBV gH和gL复合体可能作为配体发挥作用。gH和gL复合体由gp85、gp25、gp42 3种糖蛋白构成，参与病毒包膜与靶细胞的融合以及EBV感染细胞与邻近细胞的融合。EBV可与CD21阴性上皮细胞高亲和性结合，但缺乏gH/gL的重组病毒则失去这种能力[14]，这表明上皮细胞可能存在特异性gH/gL受体支持其与EBV黏附。现已证明gH/gL和整合素αvβ6、αvβ8结合可以诱发EBV和上皮细胞膜融合[15]。另外，从B细胞释放出的EBV颗粒缺乏gp42，从而更易感染上皮细胞，但感染B细胞的能力减弱，而由感染上皮细胞释放的EBV具有gp42，可有效地感染B细胞[16]。

2.1.2.3 EBV编码的膜蛋白BMRF2和极化上皮细胞整合素之间的相互作用 EBV编码的膜蛋白BMRF2和极化上皮细胞整合素之间的相互作用被认为是EBV黏附到细胞表面的一种方式。BMRF2不需要通过细胞间融合，BMRF2中的三肽Arg-Gly-Asp(RGD)可作为整合素β1、α5、α3、αv的配体而发挥作用[17]。在口腔上皮细胞中，BMRF2在EBV从细胞到细胞间扩散中也发挥了重要作用[18]。但尚不清楚的是，BMRF2与整合素的作用是发生在EBV与上皮细胞黏附前还是之后。

2.1.2.4细胞之间的接触作用 EBV可能通过胃上皮细胞和感染EBV的淋巴细胞间的接触作用进入上皮细胞[19]。Shannon-Lowe等[20]研究表明，负载在B细胞表面的EBV颗粒可促进B细胞和共培养的上皮细胞之间形成病毒突触(VS)样细胞间连接。通过VS这样一个黏附连接可以有效地将病毒从病毒感染的细胞转移到未受感染的靶细胞而不通过细胞间融合。鼻咽和口咽部黏膜淋巴细胞明显减少，而唾液中游离病毒可以先感染B细胞，然后通过B细胞和上皮细胞间的连接有效地转移到咽上皮细胞中。

2.1.2.5 EBV感染与胃黏膜损伤有关 EBVaGC患者有更频繁的木粉和金属接触史，膜损伤和后续的膜再生可能诱发胃黏膜感染EBV。墨西哥的一项调查发现，从而使肿瘤细胞增殖，肿瘤侵袭能力增强。在EBVaGC癌变区域附近的溃疡区域观察到EBER[21]。胃黏膜损伤部位易聚集淋巴细胞或有淋巴系统经过，因此猜测可能是感染EBV的淋巴细胞被聚集到损坏或再生的胃黏膜而发生EBV感染。

2.2 EBV在胃癌发病中的作用

2.2.1 CpG岛甲基化 与正常细胞相比，在癌细胞中存在大量肿瘤抑制基因启动子区域的CpG岛甲基化。在EBVaGC中启动子甲基化较频繁，研究表明EBV相关肿瘤和高CpG岛甲基化表型(CIMP)相关[22]。在EBVaGC中观察到了锌指蛋白4(CXXC4)和金属蛋白酶抑制剂2(TIMP-2)的甲基化[23]。CXXC4是Wnt通路抑制基因，下调CXXC4可促进肿瘤细胞增殖和侵袭性[24]，下调TIMP-2可能促进肿瘤细胞的转移。

近年来研究表明，在EBVaGC中，约50%的EBVaGC LMP2A阳性，LMP2A在胃癌细胞中可通过诱导细胞周期素E(cyclin E)的表达而促进细胞增殖，也可有效抑制转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的细胞凋亡。据报道，LMP2A诱发信号转导和转录激活因子-3(STAT3)的磷酸化，其可激活DNA甲基转移酶1(DNMT1)转录和通过第10染色体同源丢失磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)启动子的CpG岛甲基化造成PTEN表达损失，从而使肿瘤细胞增殖，肿瘤侵袭能力增强。在EBV感染的不显著表达LMP2A的胃上皮细胞中可见DNMT1过表达[25]。

然而，胃上皮感染EBV的早期阶段DNA甲基化准确的分子机制仍不完全清楚。

2.2.2 微小RNA(miRNA)和致癌作用 miRNA是一类内源性非编码单链RNA分子，长21～25 nt。miRNA可抑制mRNA翻译合成蛋白质，并可能通过RNA介导的DNA甲基化从而导致基因沉默。miRNA在调节生长、凋亡、变异、增殖等相关基因表达调控方面起着重要作用[26]。

EBV编码大量miRNA，EBV编码的BamH I-A 向右开放读码框转录产物(BART)miRNA作用于病毒基因3个非编码区(UTRs)：BALF5、LMP2A和LMP1，对这些病毒基因表达进行负调节，从而促进细胞生长，逃避宿主免疫反应，促进肿瘤发生[27-29]。另一方面，EBV miRNA抑制p53正向细胞凋亡调控因子(PUMA)和促凋亡蛋白BIM等，抗细胞凋亡，促进肿瘤生长[30]。EBV miRNA一部分结合基序只在EBV基因中发现，而其他病毒基因组未发现。miR-200家族是miRNA中一员，其对上皮来源肿瘤的增殖，侵袭和转移具有重要的调节作用。下调细胞miRNA家族miR-200可引起上皮-间质转变(EMT)，从而促进肿瘤侵袭转移[31]。这种现象在EBVaGC和鼻咽癌细胞恶性转化过程中是一个重要步骤。EBV相关肿瘤的进展可能是由于EBV调节病毒和宿主miRNA的表达。

2.2.3 EBV编码的BamH I-A区域的早期裂解基因BARF1的抗凋亡作用 BARF1是EBV编码的癌基因，高达90%的EBVaGC组织中可检测到BARF1[32]。研究表明BARF1为抗凋亡因子，在EBVaGC中研究发现胃癌细胞中BARF1的表达可以增加Bcl-2从而抑制凋亡，促进癌细胞增殖[33]。

3 EBVaGC的诊断和治疗及预后

3.1 诊断 对于胃癌，内镜是最有用的诊断方式。内镜下，EBVaGC表现为胃的上部出现表浅糜烂性病变。进展期时表现为无明确界限的溃疡[34]。肿瘤主要发生在除胃窦之外的部分。在超声内镜下，EBVaGC表现为黏膜下低回声结节，其最大厚度与宽度比值远大于EBV阴性胃癌[35]。EBVaGC很少有淋巴结侵犯，特别是黏膜下早期即使有时影像学检查怀疑淋巴结受侵，但大多病理活检证实淋巴结无转移[36]。

另外，EBER1-ISH是确定EBV感染最灵敏的方法。对接受胃镜检查的患者应用EBER1-ISH对其胃黏膜活检样本进行诊断在接受治疗前是非常有用的。EBVaGC患者的血清中抗EBV抗原抗体升高，但EBNA1抗体滴度在患者和健康人中差异不显著。

3.2 治疗 到目前为止，EBVaGC尚无特定的治疗方法。因为在EBVaGC中未分化型胃癌发病率较高，大多数EBVaGC患者行手术切除。多种肿瘤相关基因启动子的CpG岛甲基化在胃癌的发展中发挥着重要的作用。相对于无EBV感染的胃癌，在EBVaGC中更频繁地观察到启动子甲基化。肿瘤抑制基因的甲基化是一个关键的异常，去甲基化剂可以促进EBV潜伏感染细胞中EBV裂解性感染，可能导致癌细胞溶解，这种方法可以考虑应用到治疗EBVaGC[37]。另外，早期的EBVaGC淋巴结转移率低，可考虑行局部治疗如内镜下治疗。有报道称对早期黏膜下EBVaGC患者经行内镜下治疗，超过4年未发现其复发[38]。

有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)及蛋白激酶Cδ是细胞毒性药物诱导裂解EBV的3条重要信号传导通道，其中PI3K/Akt信号传导通路参与很多重要生物学过程的调控，其过度激活可导致肿瘤的发生，PKB/Akt和PI3K在免疫系统中起着负调节作用。PI3K的活化和PIP3的产生是B细胞受体介导信号途径的关键，而PKB/Akt位于PI3K的下游，因此反馈调节PI3K途径可认为是下调B细胞反应的一种机制。在正常组织中PI3K/Akt信号转导途径处于活化状态，但是该通路如果被过度激活则可通过下调肿瘤抑制蛋白p53、刺激蛋白质合成、抑制细胞凋亡等导致肿瘤细胞的无限增殖，成为肿瘤预后不良的标志，因此抑制该通路的激活有利于肿瘤治疗。对于EBVaGC，化疗十分棘手，因为其对紫杉醇、顺铂、5-氟尿嘧啶(5-FU)等细胞毒性药物显著耐药[39]。Shin等[40]研究结果显示，5-FU联合PI3K抑制剂——LY294002可能克服EBVaGC对5-FU 耐药的现状。

另外，约50%的EBVaGC LMP2A阳性，LMP2A在EBV潜伏感染及转化细胞过程中发挥了重要作用，具有潜在的T 细胞激活表位，能介导杀伤性T细胞发挥作用，是EBV相关肿瘤治疗的理想靶抗原[41]。腺病毒载体是目前介导基因转移及基因治疗最常用的载体系统之一，在肿瘤基因治疗中本身可以作为佐剂，增强体液免疫和细胞免疫，提示腺病毒载体是目前介导外源基因转染树突细胞效率最高的较理想载体。利用腺病毒载体介导EBV LMP2A 基因在树突细胞中表达，刺激T细胞产生EBV-LMP2A 特异性细胞毒性T淋巴细胞，有望用于EBVaGC的生物免疫治疗。

3.3 预后 大多数研究没有显示EBV与胃癌预后有关。而来自荷兰的一项研究表明EBVaGC比EBVnGC淋巴结转移频率低，EBVaGC相对于EBVnGC有良好的预后[42]。

综上所述，EBV感染与某些胃癌的发生发展相关，但EBV感染胃黏膜上皮细胞的机制以及EBV在胃癌发生、发展中的作用还不清楚。进一步深入研究EBV感染与EBVaGC的关系及其具体作用机制，对预防和治疗EBVaGC具有指导意义，以期找到特异的诊治方法及相应的有效药物。

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